纳米孔无标记实时监测B-DNA与Z-DNA构象转换的单分子技术

《ACS Nano》：Nanopore Label-Free Monitoring of B-DNA and Z-DNA Conformational Transition in Real Time

本研究发现纳米孔技术可实时区分B-DNA与Z-DNA构象转变，通过检测DNA穿过纳米孔时电流调制变化，实现单分子水平动力学研究，为基因表达调控和疾病机制提供新视角。

　　

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   引言
   脱氧核糖核酸（DNA）作为生物体遗传信息的携带者，除了经典的B型双螺旋结构外，还具有显著的结构可塑性，能够折叠成多种对生物功能重要的替代构象，包括Z-DNA、G-四链体、i-motif、三链DNA等。其中，Z-DNA因其左手螺旋方向和碱基对交替反向（anti-syn）取向的特征而备受关注。与B-DNA相比，Z-DNA骨架带负电的磷酸基团距离更近，导致静电排斥增强。Z-DNA在转录、核小体定位、DNA修复和遗传不稳定性等生物过程中发挥关键作用，并与血液恶性肿瘤、自身免疫性疾病和阿尔茨海默病等人类疾病相关。

由于Z-DNA在正常细胞条件下形成能量不利，B-DNA向Z-DNA的转换仅在特殊条件下发生。例如，Z-DNA最易在嘌呤和嘧啶交替的序列中形成，其中（CG）_n重复最有利于其稳定。转录过程中产生的负超螺旋是体内稳定Z-DNA构象的主要因素，而将大基团引入特定碱基或提高盐浓度以减轻磷酸骨架的静电排斥也可促进B-Z转换。目前区分和监测B-DNA与Z-DNA构象转换的方法包括先进光谱技术、单分子研究和结构生物学方法，但本研究报道了一种全新的纳米孔技术，用于无标记实时监测B-DNA和Z-DNA构象转换，并在单分子水平探索反应动力学。

纳米孔技术通过监测单个分析物分子与纳米级孔道通过/相互作用产生的离子电流调制（事件），已成为探索各种应用的强大工具。其中事件频率可实现分析物浓度的定量测定，而停留时间（τ_off）和阻塞幅度提供分子身份信息。在过去的二十年中，纳米孔传感已广泛应用于研究酶动力学、分子相互作用、DNA测序及其二级结构分析以及多种物种的生物传感。然而，其在DNA构象测定中的应用鲜有报道。本研究使用工程化α-溶血素（α-HL）（M113）₇蛋白纳米孔，通过研究（CG）₆在不同盐条件下的传输，系统研究B-DNA和Z-DNA的转换与区分。研究发现纳米孔提供了一种强大的方法，可直接实时“可视化”Z-DNA和B-DNA之间的构象转换，并在单分子水平研究反应动力学。

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   结果与讨论
   与典型B-DNA相比，Z-DNA直径更小（1.8 nm对2.0 nm），螺距更长（4.46 nm对3.4 nm）。此外，与B-DNA不同，Z-DNA具有明显的锯齿形磷酸骨架且为左手螺旋。这些几何和结构的显著差异可能导致B-DNA和Z-DNA通过适当设计的纳米孔时产生特征迥异的电流调制。为验证这一概念，初步实验研究了（CG）₆（序列：5′-CGCGCGCGCGCG-3′）在工程化α-HL（M113F）₇孔中的传输，电解质溶液NaCl浓度范围为1 M至4 M。在1 M NaCl条件下，（CG）₆产生一种主导类型的事件，噪声水平较小，平均停留时间为137 ± 12 ms，归一化残余电流（I_r/I_o）为0.098 ± 0.001。当NaCl浓度增加至2 M时，除小噪声事件外，出现了一种新类型的事件（称为大噪声事件），具有主要在两个水平的亚态调制。这些大噪声事件通常在电流调制结束时伴有瞬时向下尖峰，表明（CG）₆退出纳米孔。有趣的是，底部事件水平（即水平2）的残余电流略小于小噪声事件。随着NaCl浓度进一步增加，小噪声事件频率降低，而大噪声事件频率增加。当盐浓度增至4 M时，小噪声事件几乎消失。

聚类分析显示，随着NaCl浓度增加，大噪声事件和小噪声事件分别观察到更宽和更窄的标准偏差（SD）范围。尽管不能排除这些事件是由于盐诱导的DNA-孔相互作用变化或不同双链DNA解链途径所致，但观察结果的一种可能解释是大噪声事件归因于Z-DNA，而小噪声事件由B-DNA产生。为支持这一假设，采用圆二色（CD）光谱评估（CG）₆在不同盐浓度下的构象变化。CD实验表明，在1 M和2 M NaCl溶液中，（CG）₆的CD光谱在240-260 nm处显示大负峰，在270-280 nm处显示正峰，这是右手B型DNA的经典特征。随着NaCl浓度增加，240-260 nm峰负值减小，290-300 nm处出现新峰且负值增加，B型DNA的270-280 nm正峰发生蓝移。特别是在4 M NaCl时，260-270 nm处出现大正峰，这是Z-DNA构象的明确标志。CD实验证实（CG）₆在1或2 M NaCl溶液中主要采用B-DNA构象，但在4 M NaCl时形成稳定Z-DNA，验证了盐诱导的DNA构象转换。

为简化事件分析，将单个事件作为整体分析，基于其在纳米孔中的整个持续时间计算事件停留时间（τ_off），包括进入、解链/转运和退出过程的时间。该策略有效区分了B-DNA和Z-DNA。事件停留时间与阻塞幅度的聚类分析显示，（CG）₆在1 M NaCl中产生单个B-DNA簇，阻塞约90%，停留时间分布宽（约3个数量级）。随着NaCl浓度增加，出现明显的Z-DNA簇，特征为幅度变异性更大，停留时间范围更窄。B-DNA事件频率降低，而Z-DNA事件在4 M NaCl中占主导。有趣的是，随着NaCl浓度增加，B-DNA的停留时间迅速减少（从1 M NaCl的136.8 ± 12.2 ms至3 M NaCl的40.6 ± 13.9 ms），而Z-DNA的停留时间略有增加（从2 M NaCl的860.2 ± 88.6 ms至4 M NaCl的1085.6 ± 139.6 ms）。由于较高盐浓度通常稳定双链体并减少电泳驱动力，增加NaCl浓度预计会增加DNA通过纳米孔的事件停留时间。观察到的B-DNA与Z-DNA事件停留时间的不同盐效应表明，离子强度调制的DNA与纳米孔内壁之间的静电相互作用在DNA转运中也起重要作用。

此外，为深入了解Z-DNA转运，进一步研究电压对（CG）₆在α-HL（M113F）₇纳米孔中转运的影响。发现在1 M和4 M NaCl溶液中，事件停留时间随施加电压增加而减少，而频率增加，为B-DNA（在1 M NaCl中）和Z-DNA（在4 M NaCl中）在纳米孔中的转运性质提供有力证据。进一步分析表明，（CG）₆在纳米孔中转运的自由能（ΔG_off^?）值在1 M NaCl和4 M NaCl中分别为81.1和78.7 kJ/mol，其中ΔG_off^?基于Eyring方程确定。结果表明，在实验条件下，Z-DNA的转运具有比B-DNA更小的能量或熵垒。为证明上述发现具有代表性，进一步研究另外两个具有更长CG重复的DNA序列（（CG）₈和（CG）₁₀）和两个额外纳米孔（野生型和突变型（M113K）₇α-HL）。发现所有三种DNA序列在不同盐溶液（1 M对4 M NaCl）中产生特征迥异的事件，表现为不同的阻塞噪声水平和/或幅度，具体取决于所用纳米孔。

为进一步支持上述假设，即两种特征显著不同的事件出现归因于不同的B-DNA和Z-DNA构象而非非特异性盐效应，接下来研究富含AT的DNA链（AT）₁₀（序列：5′-ATATATATATATATATATAT-3′）在（M113F）₇α-HL纳米孔中的转运。与（CG）₆在这两种盐溶液中存在两种不同构象（B-DNA对Z-DNA）不同，（AT）₁₀仅采用典型B型，如CD实验所证明。因此，在（AT）₁₀的纳米孔单通道记录中未观察到特征性的（CG）₆Z型嘈杂两水平电流调制。数据分析显示，与1 M NaCl相比，（AT）₁₀在4 M NaCl中具有略大的平均停留时间（1.74 ± 0.30 ms对1.36 ± 0.07 ms），但事件频率显著较小（1.76 ± 0.30 s^–1对7.71 ± 1.58 s^–1）。结果考虑较高盐浓度提供增强的静电屏蔽，减少驱动带负电DNA通过孔的电泳力。此外，离子强度调制的DNA与纳米孔内壁之间的静电相互作用也可能促成观察到的现象。相比之下，（CG）₆在4 M NaCl中的事件停留时间远大于1 M NaCl（727 ± 55 ms对109.9 ± 8.0 ms）。为确定上述观察是否具有代表性，进一步研究（AT）₁₀在其他电压值下在1和4 M NaCl溶液中的转运。发现在每个研究的施加电位下，（AT）₁₀在4 M NaCl中的停留时间略大于1 M NaCl，而事件频率小得多。此外，（AT）₁₀转运的停留时间和电压显示反向关系，表明电泳力是驱动（AT）₁₀通过纳米孔的主导因素，（AT）₁₀-纳米孔相互作用弱。这些发现与（CG）₆研究中观察到的显著不同，其中（CG）₆的停留时间和电压显示指数关系，在1 M NaCl中而非4 M NaCl中观察到更大斜率。综合实验结果表明，（CG）₆事件特征的显著差异，如小噪声事件对嘈杂两水平电流调制及其在不同盐浓度下事件停留时间的变化，最可能由于构象变化（B-DNA和Z-DNA之间）而非一般盐效应。

为探索纳米孔在实时无标记监测B型和Z型DNA之间构象转换的效用，进行两个额外实验。在一个实验中，将制备在1 M NaCl中的（CG）₆DNA（即B-DNA）引入浸泡在4 M NaCl电解质溶液中的α-溶血素纳米孔，随后实时不间断监测其转运。在另一个实验中，将制备在4 M NaCl中的（CG）₆DNA（即Z-DNA）引入浸泡在1 M NaCl电解质溶液中的α-溶血素纳米孔。结果显示，在1 M NaCl电解质溶液中，制备在4 M NaCl中的（CG）₆仅在转运早期产生两水平电流调制，表明其仍保持Z-DNA构象。然而，随时间推移，除两水平电流调制外，出现具有小噪声的新类型事件，该事件具有与B-DNA相同的残余电流，表明部分Z-DNA构象已转换为B-DNA。当时间达到约100秒时，两水平电流调制几乎消失，表明Z-DNA向B-DNA转换几乎完成。在4 M NaCl电解质溶液中，制备的B-DNA仅在转运早期产生一种主要类型的小噪声水平事件，表明其结构当时完整。随时间推移，观察到具有两个亚态水平的新类型事件，表明B-DNA向Z-DNA转换发生。综合实验结果进一步强证这些