《ACS Sensors》：An Electrically Activated Nanobody Biosensor for On-Demand Detection
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本文介绍了一种创新型电激活纳米抗体（Nb）生物传感器平台，通过电响应寡肽（10EA）动态调控纳米抗体结合位点的暴露与屏蔽，实现从“关闭”（OFF）到“开启”（ON）状态的精准切换。该系统在复杂介质（如血清、细胞培养基）中表现出高灵敏度（pg/mL级）、宽动态范围（pg/mL–μg/mL）及可寻址的多重检测能力，为生物制造、医疗诊断和环境监测提供了可编程、高性能的分子检测新范式。
Biosensor Fabrication
该按需传感策略的核心原理是利用金电极表面构建混合单层，由纳米抗体识别元件和寡肽响应单元组成。通过寡肽的净电荷，在施加电场下控制其相对于金 transducer 表面的取向，从而屏蔽（OFF）或暴露（ON）纳米抗体的抗原结合位点。具体制备过程包括：首先在金电极上自组装11-巯基十一烷酸（11-MUA）单层（SAM），提供羧基用于后续偶联；然后通过碳二亚胺化学一步法共固定纳米抗体和寡肽。研究选用增强型绿色荧光蛋白（eGFP）纳米抗体作为模型识别元件，其靶抗原eGFP分子量适中（<30 kDa）。寡肽设计包含生理pH下带负电的谷氨酸残基，以在施加电位下实现构象控制，并通过末端β-丙氨酸残基实现定向偶联。初步测试发现，较短的7聚谷氨酸（7EA）寡肽无法完全屏蔽纳米抗体结合位点，因此选用更长的10聚谷氨酸（10EA）以确保在静态（开路电位，OCP）下实现完全的OFF状态。
电化学阻抗谱（EIS）用于确认电极功能化成功，通过监测氧化还原对[Fe(CN)6]3?/4?在电极-溶液界面的电子转移。数据显示，随着10EA比例增加，电荷转移电阻（Rct）显著上升，例如纯纳米抗体表面Rct为1204 ± 191 kΩ，而1:2 Nb:10EA比例下升至2365 ± 621 kΩ，这归因于带负电的寡肽排斥氧化还原探针，阻碍电子转移。
Nanobody OFF to ON Activation
选择+0.3 V作为激活电位，因其在肽和硫醇SAM的电化学稳定窗口内，能有效诱导寡肽塌陷而不破坏单层完整性。在OCP下，1:2 Nb:10EA传感器对eGFP的响应为19 ± 6%，表明结合位点被屏蔽（OFF状态）；施加+0.3 V后，响应降至?78 ± 6%（p < 0.01），激活效率达80%。更高比例（1:5）的寡肽会形成空间屏障，阻碍构象变化，而1:1比例则无法完全屏蔽结合位点。特异性实验显示，非特异性蛋白RFP在+0.3 V下响应显著低于eGFP（p < 0.01），且电位应用未引起表面降解，证实响应源于抗原特异性结合而非电场长程效应。
Sensor Characteristics
1:2 Nb:10EA传感器表面亲水性适中（前进接触角66 ± 5°），厚度为3.0 ± 0.4 nm。X射线光电子能谱（XPS）证实混合单层形成，显示纳米抗体表面氮比例更高，而硫比例降低表明寡肽占据部分表面空间。计算表面Nb:10EA比例为7:1，高于溶液比例（1:2），源于纳米抗体通过多个赖氨酸残基更易固定，而带负电的寡肽因静电排斥吸附效率较低。
Evaluation of Biosensor Performance
在PBS和RPMI培养基中，传感器均保持从OFF到ON的激活能力。电激活传感器灵敏度显著提升，检测限（LoD）达4.5 pg/mL（PBS）和5.0 pg/mL（RPMI），动态范围扩展至pg/mL–μg/mL（较纯纳米抗体传感器扩大100倍）。这得益于寡肽引入的额外空间减少了纳米抗体拥挤，增强结合位点可及性。在干细胞培养上清和胎牛血清（FBS）中，传感器仍能有效区分OFF/ON状态，尽管10% FBS会引入噪声，但特异性未受影响。
On-Demand Sensing in a Multiarray
利用丝网印刷多电极阵列（SPE）构建可独立寻址的传感器平台。在6小时内，依次激活四个工作电极（WE），每个电极在+0.3 V下特异性检测eGFP，而OCP电极保持OFF状态。结果证实，寡肽屏蔽有效防止非特异性结合，实现时序可控的多重检测。
该电激活纳米抗体平台通过寡肽动态门控机制，实现了高性能、可编程的分子检测，在复杂生物环境中具有广阔应用前景。
