《Advanced Science》：Bioprinting of Microtissues Within Mechanically Tunable Support Baths to Engineer Anisotropic Musculoskeletal Tissues
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本综述创新性地提出一种将间充质干细胞（MSC）来源微组织（μT）与力学可调甲基丙烯酸化黄原胶（XG-MA）支撑浴相结合的新型生物打印平台。研究证实，通过调控支撑浴刚度可精准引导μT融合方向、细胞分化命运（软浴促软骨形成，硬浴诱导（肌）纤维生成）及胶原纤维排列，成功构建出具有用户定义胶原结构的关节软骨、半月板和韧带移植物，为仿生各向异性组织规模化制造提供了突破性策略。
引言
组织工程领域致力于修复因创伤或疾病受损的组织器官，其核心挑战在于构建能复刻天然组织复杂结构、成分与功能的再生移植物。这对肌肉骨骼组织（如关节软骨、半月板、韧带）尤为重要，其独特的生物力学功能源于细胞外基质（ECM）的特化架构。传统策略通常将干细胞接种于3D支架或水凝胶中，但难以生成具有仿生胶原网络结构的表型明确组织。近年来，无支架方法利用细胞自组织能力（类似胚胎发育过程）形成微组织（μT）或类器官，但如何规模化组装并引导其（再）建模仍是难题。发育生物学研究表明，周围组织的机械约束会显著影响组织形成，提示将生物物理线索整合到生物打印策略中的必要性。3D生物打印虽能空间排列细胞，但在精确图案化μT、促进融合及引导长期表型方面存在局限。新兴的支撑浴概念（如可牺牲墨水或临时适配墨水）为解决这些难题提供了新思路。
结果与讨论
开发用于微组织挤出生物打印的时序适配支撑浴
为实现μT的高密度打印，研究团队选用1%明胶作为牺牲性生物墨水（其温度依赖性粘度可防止μT在打印前沉降），并开发了可光交联的甲基丙烯酸化黄原胶（XG-MA）作为非牺牲性支撑浴。通过核磁共振氢谱（1H-NMR）确认XG成功接枝甲基丙烯酸基团，使材料在UV照射后形成稳定网络。机械测试显示，XG-MA浓度从0.25%增至2%时，其杨氏模量从20 kPa升至65 kPa，且所有浓度均表现出剪切稀化和触变性，适合高分辨率打印。优化μT密度为45,000 μT mL?1时，可形成连续组织丝。打印后发现，支撑浴浓度不仅影响初始丝径（软浴丝径达1.5–2 mm，硬浴仅0.25–0.5 mm），还通过施加径向压缩力驱动丝径随时间收缩（尤其在软浴中更显著），表明支撑浴对打印结构具有长期力学约束作用。
支撑浴刚度调控MSC微组织中的YAP激活
YAP作为Hippo信号通路的关键机械感应蛋白，其活性受ECM刚度调节。在含TGF-β3的培养基中培养打印构造后，免疫荧光染色显示，较硬支撑浴（1%和2% XG-MA）中μT的YAP核定位显著增强，表明机械环境通过细胞骨架张力激活YAP信号，为后续表型分化奠定基础。
支撑浴刚度决定微组织表命运
在TGF-β3诱导下，支撑浴刚度直接调控MSC分化方向：软浴（0.25%和0.5% XG-MA）促进软骨相关基因（COL2A1、COMP、ACAN）表达和II型胶原沉积，抑制α-SMA（ACTA2）生成；硬浴（2% XG-MA）则显著上调韧带/肌腱标志物（COL1A1、TNC、ACTA2），驱动（肌）纤维形成；中等硬度浴（1% XG-MA）诱导纤维软骨表型，同时沉积糖胺聚糖（sGAG）和I型胶原。组织学与生化分析进一步证实，软环境促进sGAG积累，硬环境增强I型胶原合成。
支撑浴刚度引导打印组织内胶原纤维排列
为构建各向异性软组织，团队利用偏振光显微镜（PLM）分析4周培养后的胶原结构。皮 Sirius红染色显示，硬浴中胶原沉积更均匀且纤维沿打印方向（0°）高度对齐（相干性接近1），软浴中排列较分散。扫描电镜（SEM）显示胶原纤维直径介于20–60 nm，与天然组织相当。定量表明硬浴显著提升胶原/DNA比值，证实其有效引导ECM有序组装。
通过空间图案化微组织至不同刚度支撑浴实现各向异性肌肉骨骼组织生物打印
为验证平台应用潜力，研究团队通过调整打印路径和浴刚度，成功构建三种组织：在0.5% XG-MA浴中打印贝宁霍夫弓状结构模拟关节软骨，PLM显示表层纤维平行（0°）、深层垂直（90°）排列，且II型胶原丰富；在1%浴中环形打印半月板构造，实现圆周对齐的纤维网络及I/II型胶原共沉积；在2%浴中平行打印三层韧带组织，呈现高度线性排列的I型胶原及α-SMA阳性细胞。所有构建均使用相同培养基（TGF-β3），仅靠支撑浴物理特性定向分化与结构重塑。
结论
本研究开发的力学可调支撑浴生物打印平台，通过时空控制μT的物理边界，实现了表型可编程与ECM架构可定制的各向异性组织工程。该策略模拟发育过程中机械线索指导组织自组织的原理，为规模化制造功能化肌肉骨骼移植物提供了新范式。
实验方法
关键实验包括XG-MA的甲基丙烯酸化修饰与表征、流变学测试（振幅扫描与屈服应力测定）、山羊骨髓MSC分离与μT制备（琼脂糖微孔阵列法）、明胶/μT生物墨水优化、挤出打印参数（6 μL s?1速率，2 mm s?1速度）及UV交联（4 min）。分析手段涵盖Live/Dead染色、qPCR、免疫组化、SEM组织形貌观察及PLM胶原取向定量等。统计采用ANOVA与Tukey事后检验，显著性阈值p<0.05。
