揭示白藜芦醇对抗败血症中中性粒细胞介导的过度炎症的治疗潜力：一种基于计算机模拟（in-silico）、分子对接（molecular docking）和体外实验（ex-vivo）的研究方法

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Unveiling the therapeutic potential of Resveratrol against neutrophil-mediated hyperinflammation in sepsis: An in-silico, molecular docking, and ex-vivo approach

Sepsis研究通过GEO数据集分析发现9个DEGs（S100A12等），PPI网络显示其关键作用，分子对接证实Resveratrol与S100A12高亲和力，ex-vivo实验显示Resveratrol可抑制自由基、NO及NETs形成。

　　

Gaurang Agarwal|Sarvjeet Das|Anshu Kumar|Juhi Saxena|Praveen Kumar Verma|Kuldeep Viramgam|Arti Muley|Anupam Jyoti

古吉拉特邦瓦多达拉帕鲁尔大学应用科学学院生命科学系

摘要

背景

败血症是一种严重的疾病，其特征是过度炎症，常常导致器官功能障碍和死亡。目前使用的药物是非特异性的，并且会产生严重的副作用。因此，需要寻找针对过度炎症的患者特异性药物。

方法

通过对多个GEO数据集[GSE63311、GSE95233和GSE28750]进行计算机模拟分析，以识别败血症中的差异表达基因（DEGs）。使用了包括Cytoscape进行枢纽基因识别、STRING进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析、网络分析和功能富集、KEGG通路富集分析以及基因本体论分析等计算机模拟工具。此外，还进行了分子对接实验，以评估配体与目标蛋白之间的相互作用。进一步地，我们通过让健康志愿者和败血症患者的中性粒细胞在有无大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的情况下进行体外研究，研究了自由基生成、NO生成以及中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成，其中Resveratrol（RSV）的存在与否对实验结果有影响。

结果

确定了9个潜在的枢纽基因，即< />和ANXA3，这些基因在促炎、免疫调节和代谢过程中起作用，被认为是DEGs。使用Cytoscape CytoHubba插件生成的PPI网络将这些基因识别为败血症进展的关键节点。分子对接研究证实了RSV与S100A12的结合亲和力。在RSV存在的情况下，人类中性粒细胞中的自由基和NO生成、NETs释放以及p38 MAPK磷酸化显著减弱。

结论

本研究确定S100A12是潜在的治疗靶点，可以减轻败血症中的中性粒细胞驱动的过度炎症，从而显示出RSV在对抗败血症方面的治疗潜力。

引言

败血症是一种复杂的临床综合征，由身体对感染的失调反应引起，导致全身炎症，损害器官，如果不治疗，最终可能导致死亡。据估计，它是第三大常见死因，每年造成约2140万人死亡[1]。在资源匮乏的低收入和中等收入国家，死亡率很高。目前使用的治疗方法包括使用抗菌药物、液体复苏和血管加压剂。过度使用抗生素可能导致抗生素耐药性和继发感染[2]。免疫调节疗法（如皮质类固醇）效果有限，并伴有免疫抑制的风险[3]。尽管治疗方法有所进步，败血症仍然对临床医生来说是一个挑战，死亡率仍未下降[4]。因此，迫切需要寻找新的药物来针对败血症的根本原因，同时尽量减少副作用。

中性粒细胞是首先到达感染和炎症部位的一线免疫细胞。败血症的病理生理学涉及由中性粒细胞激活引发的过度炎症阶段[5]。在此过程中，中性粒细胞产生活性氧和一氧化氮，有助于对抗病原体[6][7]。此外，中性粒细胞通过释放由染色质、颗粒蛋白和组蛋白组成的胞外陷阱（NETs）来杀死病原体[8]。然而，不受控制的中性粒细胞NETs形成以及NETs的不适当清除会导致组织损伤和器官功能障碍[9]。这些中性粒细胞及其炎症介质在过度炎症期间不平衡激活的特性，突显了它们在疾病进展中的双重作用：既是保护者也是促进者[10]。

S100A12，也被称为新发现的晚期糖基化终产物（EN-RAGE）结合蛋白的胞外受体，是一种钙结合的警报蛋白，在中性粒细胞的细胞质中广泛分布，是这种失调炎症的主要原因[11]。在败血症的早期阶段，特别是进展为多器官功能障碍综合征（MODS）[12]和肺结核[13]的患者中，S100A12的血清浓度显著升高。S100A12被认为是败血症的独立风险因素和潜在的治疗靶点[14]。

白藜芦醇[3,5,4′-三羟基-反式-芪]（RSV）是一种天然多酚，通常存在于红葡萄中。RSV具有抗癌、抗糖尿病作用，并对心血管和神经退行性疾病具有保护作用。RSV的多重作用归因于其抗菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化和抗炎特性[15][16]。

我们假设RSV可能以高结合亲和力靶向关键的中性粒细胞相关枢纽基因，通过调节氧化应激和炎症反应来减轻过度炎症，从而在体外条件下显示出治疗潜力。在这项研究中，我们使用GEO数据集、STRING进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析、网络分析和功能富集、KEGG通路富集分析以及基因本体论分析，确定了与败血症相关的枢纽基因。我们基于排名最高的基因采用了计算机模拟方法。通过分子对接确定了RSV与S100A12之间的结合亲和力。此外，还采用了体外方法来评估具有抗炎和抗氧化特性的天然多酚RSV的治疗潜力。

材料

右旋糖酐、Histopaque、Trypan blue、白藜芦醇、Triton X-100、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）、Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）、Diphenyleneiodonium chloride（DPI）、4,5-二氨基荧光素二乙酸酯（DAF-2DA）和Poly-L-Lysine从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得；Sytox Green从Thermo Fisher Scientific（美国）获得；p38 MAPK磷酸化试剂盒从Abcam（英国）获得。

数据收集

在这项研究中，我们识别了三个与败血症相关的GEO数据集，即GSE63311 [17]

差异表达分析

从三个GEO数据集中，共识别出多个败血症样本中的差异表达基因（DEGs）。显著上调的主要基因包括< />和ANXA3，这些基因对败血症发作时的炎症和免疫系统激活至关重要。GSE数据集[GSE28750、GSE63311、GSE95233的火山图、均值差异图和箱线图如图1所示。

GSE数据集的维恩图分析

维恩图用于展示数据的交集和独特性

讨论

败血症仍然是一种危及生命的疾病，主要是由于免疫反应失调，其中过度炎症在组织损伤和多器官衰竭过程中起主导作用。除了少数抗生素外，大多数治疗方法仅作为支持性护理，缺乏中断潜在炎症级联的特异性。通过靶向关键炎症介质来调节免疫反应的治疗策略具有潜力。

CRediT作者贡献声明

Praveen Kumar Verma：撰写 – 审稿与编辑。Juhi Saxena：撰写 – 审稿与编辑。Anshu Kumar：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据管理。Sarvjeet Das：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究、正式分析。Kuldeep Viramgam：研究、正式分析。Anupam Jyoti：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、研究、资金获取、正式分析、概念构思。Arti Muley：研究、正式分析

未引用的参考文献

[57]。

参与同意

所有参与者均已同意参与本研究。

潜在利益冲突的披露

代表所有作者，通讯作者声明不存在利益冲突

数据可用性声明

不适用

伦理声明

已获得帕鲁尔大学人类研究机构伦理委员会[PUIECHR/PIMSR/00/081734/7502]的伦理批准和参与者同意。

资金信息

本研究得到了古吉拉特邦生物技术计划对Anupam Jyoti的财政支持[20242512]，以及帕鲁尔大学研究与发展中心的内部资助[RDC/IMSL/163]。

利益冲突声明

代表所有作者，通讯作者声明不存在利益冲突

致谢

非常感谢帕鲁尔大学的支持。