《Biosensors and Bioelectronics》：Graphene hybrid nanoprobes for targeted microbial sensing and ultralow-energy, deep-tissue, noninvasive multiphoton imaging in the NIR-I/II region
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氮掺杂与氨基功能化显著提升石墨烯量子点（GQDs）的电子供体能力，优化其与含硫、氮聚合物结合形成纳米杂化物，实现高量子产率（>0.6）、强双光子发光及优异光稳定性，适用于近红外I/II区深层生物成像。
郭文硕|林彦松|张佳媛|王久尧|陈佩琪|曾世文|林桥云|张婵琪|吴尚荣
中国医科大学儿童医院/中国医科大学医院过敏免疫学与微生物组中心，中国台湾台中市404
摘要
氮（N）掺杂和氨基功能化显著增强了石墨烯量子点（GQDs）的电子捐赠能力，从而提高了氨基-N-GQDs的电荷转移效率，并使其光物理性能远优于无氨基的N-GQDs和无氨基的氨基-GQDs。通过将氨基-N-GQDs与富含硫和氮的聚合物（如聚苯乙烯磺酸盐和聚乙烯亚胺）共轭，进一步优化了其性能，得到了光学行为显著改善的氨基-N-GQD-聚合物纳米杂化物。这些杂化纳米结构具有高量子产率、优异的光稳定性、几乎不产生活性氧，并具有强烈的双光子发光特性，使其成为非线性生物成像的理想造影剂。为了实现分子特异性，还引入了抗体功能化。当与抗脂多糖或抗TasA抗体共轭时，这些纳米杂化物能够选择性靶向大肠杆菌（E. coli）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis），在双光子激发下产生明亮的荧光、强烈的信号强度和高信噪比。使用自制的970纳米（近红外II区）Ti:蓝宝石激光系统，在极低的激发能量（E. coli为42.96 nJ/pixel^-1，B. subtilis为35.14 nJ/pixel^-1）下，经过100次扫描（总曝光时间0.666秒）后，成像深度可达270微米。这些纳米杂化物仅使用细胞自荧光所需能量的1/49和1/36即可产生双光子发光，信号增强分别约为2401倍和1296倍。这种显著的效率支持了深度、无创的成像，并凸显了氨基-N-GQD-聚合物纳米杂化物作为下一代生物医学成像中多功能近红外I/II响应探针的潜力。
引言
石墨烯量子点（GQDs）是一类重要的碳基纳米材料，因其卓越的光电可调性和多样的表面化学性质而受到广泛关注。它们的π–π共轭结构、较大的比表面积以及丰富的官能团为化学修饰和与聚合物及生物分子的杂化提供了坚实的基础（Jan等人，2025年）。这些特性，加上其高水溶性、生物相容性和尺寸依赖性的光学行为，使GQDs成为生物成像、光疗和高效能量收集领域的理想材料。GQDs的荧光来源于内在发射和缺陷相关发射两种途径。内在发射通常源于量子限制、之字形边缘电子态或激子复合。相比之下，缺陷态发射与富含氧的边缘基团和晶格畸变有关，这些因素会形成能量陷阱。因此，发射波长和量子产率（QY）强烈依赖于表面化学和晶体质量，这突显了精确化学控制以优化光学和光化学性能的必要性（ElMorsy等人，2024年）。异原子掺杂是调节GQDs电子结构的有效策略。氮掺杂的GQDs（N-GQDs）由于氮的电子捐赠效应及其对费米能级附近态的影响，表现出较窄的带隙、红移的光致发光（PL）和增强的辐射跃迁（Barati等人，2023年）。通过氨基功能化（氨基-N-GQDs），引入了共振结构，提高了最高占据分子轨道（HOMO），降低了带隙，并促进了单重态-三重态跃迁（Garcia-Basabe等人，2025年；Tetsuka等人，2012年）。这些电子修饰促进了多光子激发（MPE）下的系统间跃迁和双光子吸收（TPA）效率（Tian等人，2024年）。用聚合物对GQDs进行表面钝化是另一种提高其光物理稳定性的方法。用聚乙二醇二胺或聚丙酰亚胺-聚乙烯亚胺共轭的GQDs可以稳定表面态并抑制非辐射复合（Cui等人，2024年）。富含硫（S）和氮的聚合物（如聚苯乙烯磺酸盐PSS和聚乙烯亚胺PEI）能生成稳定的π共轭电子体系，作为保护壳层，限制分子振动并增强量子限制（Barman等人，2018年）。在多层氨基-N-GQDs中，聚合物钝化显著提高了QY和光稳定性（Magdy等人，2023年）。此外，引入富含S/N的聚合物有助于高效能量传递和表面电荷重分布，形成支持辐射跃迁的局部表面态，从而提高TPA截面。这些特性使GQD-聚合物纳米杂化物成为非线性光学应用和多光子荧光成像的理想候选材料（Kalluri等人，2023年）。
MPE技术的进步加速了GQDs等纳米材料在深层组织成像中的应用（D?ring等人，2022年；Miao等人，2025年）。在MPE方法中，双光子激发（TPE）显微镜因其使用近红外（NIR）激发而成为强大工具，能够在NIR-I和NIR-II窗口内实现深层组织穿透，与可见光照明相比散射显著减少（Nabil等人，2024年）。TPE显微镜提供高分辨率（HR）成像，光损伤小、光毒性低、热负荷小，适用于长期活细胞观察（D?ring等人，2022年；Garcia-Basabe等人，2025年）。然而，这项技术的成功在很大程度上依赖于高效且生物相容的造影剂的可用性。由于GQD衍生的纳米结构具有可调发射、优异的水稳定性和低细胞毒性，它们成为下一代多光子成像探针的理想候选者。将MPE与NIR-I/II激发结合使用，通过最小化吸收和散射同时保持高效能量传递，进一步提高了穿透深度和空间分辨率（D?ring等人，2022年）。在本研究中，我们使用了一个自制的倒置多光子显微镜系统，配备有飞秒Ti:蓝宝石激光器（80 MHz重复频率）和光学参量振荡器（Mai Tai，Spectra-Physics，美国加州）（方案S1）。该系统实现了455.15纳米的横向（x轴）和937.21纳米的轴向（z轴）分辨率，实现了高保真度的三维（3D）成像。尽管基于GQD的纳米材料在TPE成像方面具有巨大潜力，但它们作为高效双光子造影剂的应用仍需进一步探索。为解决这一挑战，我们合成并表征了一系列适用于多光子成像的GQD衍生物。值得注意的是，氮掺杂和氨基功能化的GQDs与无氨基的N-GQDs和无氨基的氨基-N-GQDs相比，表现出显著增强的发光和光稳定性。氨基表面基团增强了双光子活性和成像对比度，证实了它们在生物医学可视化和潜在诊断应用中的适用性。
为了进一步优化其非线性光学性质，引入了聚合物共轭。PSS中的S和PEI中的N在表面态产生了协同的电子捕获效应，放大了光学响应。所得的氨基-N-GQD-PSS-PEI纳米杂化物（以下简称氨基-N-GQD-聚合物）表现出显著增强的双光子发光（TPL）和超过0.6的高QY值，优于其他GQD变体。在TPE下，这些纳米杂化物作为有效的造影剂用于分析物定位和动态追踪。在非侵入性3D TPE成像中，使用970纳米激发，在极低激发能量下（B. subtilis为35.14 nJ/pixel^-1，E. coli为42.96 nJ/pixel^-1），经过100次扫描后，成像深度达到约270微米。总曝光时间约为0.666秒，每帧扫描速率为6.66毫秒，视野为200微米×200微米（详细计算见补充信息）。总体而言，本研究提出了一种综合的材料工程策略，用于制备高效、光稳定、生物相容的氨基-N-GQD-聚合物纳米杂化物，同时抑制活性氧（ROS）的产生。通过协同异原子掺杂、聚合物钝化和靶向表面功能化，我们在低能量MPE下实现了TPL强度、QY和成像深度的显著提升。这些纳米结构为实时生物成像、高对比度传感和未来集成到先进的光子生物传感系统中提供了巨大潜力。
材料表征及使用定制飞秒Ti-蓝宝石激光光学系统研究双光子性质
采用改进的Hummers方法（Hummers等人，1958年）合成氨基-N-GQDs，随后通过超声剪切处理，形成了具有明确光电特性的纳米级量子结构。低分辨率和高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）显示颗粒均匀分散，平均横向尺寸约为11.1纳米（图S1a–c）。观察到的0.213纳米晶格间距对应于石墨烯的{1 00}平面（Jan等人，
结论
开发能够在低激发功率下保持高光学效率的造影剂对于推进深层组织生物成像至关重要。在本研究中，我们报道了合理设计的氨基功能化、氮掺杂的GQDs与富含S和氮的聚合物（PSS和PEI）的结合，制备出了一类高发光的杂化纳米探针。这些纳米结构表现出显著增强的量子产率（>0.6）、较大的TPA截面和优异的光学性能
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
作者贡献声明
张婵琪：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、研究、资金获取、正式分析。
吴尚荣：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、研究、资金获取、正式分析。
张桥云：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、研究、数据管理、资金
未引用参考文献
Barman和Patra，2018；Ferrari和Robertson，2000；Hummers和Offeman，1958；Jan等人，2025；Kuo等人，2023；Li等人，2020；Nabil和Megahed，2025。
数据可用性
所使用的数据是保密的。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了台湾科技部（NSTC）（114-2622-M-039-001-；114-2320-B-006-037-；113-2320-B-006-048-；113-2221-E-006-108-MY3；112-2320-B-006-022-MY3；111-2113-M-039-003-MY2）；台湾E-Da医院（NCKUEDA11305）；中国医科大学儿童医院/中国医科大学医院过敏免疫学与微生物组中心（1JA8；DMR-115-118）；中国医科大学An Nan医院的支持。
