《PLOS Genetics》：Using TraDIS as a complementary approach to long term evolution for mapping adaptive mutations in Escherichia coli
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本文创新性地将转座子定向插入位点测序（TraDIS）技术与传统长期适应性实验室进化（ALE）相结合，通过对比分析大肠杆菌在波动pH环境下的短期（10天）转座子库筛选与长期（5个月）克隆进化实验，证实了两种方法在识别关键适应性突变基因上存在显著重叠。研究不仅验证了TraDIS可作为高效预测进化轨迹的强有力工具，还揭示了传统ALE可能遗漏的多个新适应性靶点（如cadC、yjjY、fimE），为微生物进化机制研究和高通量适应性基因筛选提供了新范式。
摘要
本研究通过系统性比较长期实验室进化（Long Evolution Experiment, LEE）与短期转座子筛选实验（Transposon Selection Experiment, TSE）的遗传学结果，探讨了利用高密度转座子库快速预测大肠杆菌适应性突变的可行性。在长达5个月的LEE实验中，大肠杆菌K-12 MG1655在初始pH为4.5的非缓冲LB培养基中经历每日传代培养，最终从五个独立进化群体中分离出的克隆株均携带arcA、cytR、rpoA等基因的重复性突变。与之对应，通过10天的TraDIS库筛选（TSE），研究人员在相同培养条件下发现转座子插入在arcA、cadC、fimE等基因的菌株显著富集。两种方法在关键适应性基因的识别上呈现高度一致性，但TSE额外揭示了多个未被LEE检测到的有益突变位点（如yjjY、sspA），证实其在高通量筛选适应性突变中的独特价值。
引言
适应性实验室进化（ALE）是研究微生物在可控环境下进化规律的核心手段，但其耗时长的特点限制了其在基因型-表型关联研究中的广泛应用。值得注意的是，进化实验中频繁出现的基因功能缺失（LoF）突变（如无义突变、基因缺失）为加速这一过程提供了突破口：通过起始于已包含大量LoF突变的转座子库，可绕过等待自发突变出现的时间瓶颈。转座子定向插入位点测序（TraDIS）技术能够通过追踪转座子插入频率的变化，快速识别在特定条件下赋予适应性优势的突变。本研究假设：短期TraDIS库筛选（TSE）的结果应与长期克隆进化（LEE）的遗传结局高度重叠，且能互补发现新的适应性基因。
在波动pH环境中被选择的突变谱系有限
在非缓冲LB培养基（初始pH 4.5）中持续传代培养5个月后，五个独立进化群体均表现出适应性提升，但其克隆分离株（E1A–E5A）的生长曲线与亲本株无显著差异。全基因组测序显示，所有克隆株均携带arcA和cytR基因的新突变，其中四株出现相同的rpoA突变，三株存在与菌毛合成或色氨酸代谢相关基因的突变。群体测序进一步证实这些突变在种群中高频存在，但部分低频突变（如gltP-yjcO间区突变）未在克隆株中检出，提示种群内可能存在未被捕获的亚群。
波动pH条件下MG1655 TraDIS库的连续传代分析
研究人员在相同大肠杆菌株中构建了包含>55万次插入的高密度转座子库，覆盖度达平均每8.1碱基一次插入。将该库在初始pH 4.5或7的LB培养基中传代10天后，通过TraDIS分析发现：随着时间推移，种群内独特插入位点数量显著下降，且插入某些基因（如yjjY、cspC）的菌株在所有重复群体中均被富集，而fimE和sspA的富集仅出现在pH 7条件下。主成分分析显示，不同重复群体随培养时间出现分化，但基因富集模式仍高度相关。
TSE与LEE鉴定基因呈现显著重叠
通过比较TSE（第10天）与LEE的突变基因集，发现arcA、cadC、tnaA等基因在两种方法中均被显著筛选。严格标准下（突变存在于≥2个克隆株），LEE鉴定的6个基因中有4个在TSE中同样富集。唯一未重叠的必需基因（rpoA、prfB）因无法在转座子库中表征而被排除，而bioH基因的突变在TSE中虽有小幅富集但未达显著性阈值。超几何检验证实，除pH 4.5条件下的部分比较外，多数重叠具有统计学显著性。
特异性案例揭示插入与适应性的间接关联
针对TSE独有基因的功能验证表明，删除cadB、yjjY等基因的菌株在竞争实验中均显示适应性提升。值得注意的是，cadB基因中的转座子插入呈现明显的反向富集倾向，推测其通过反义转录干扰下游cadC表达，进而抑制cadA（赖氨酸脱羧酶）活性而产生适应性优势。另一典型案例是yjjY-arcA调控模块：富集的转座子插入多位于yjjY基因且与arcA同向，实验证实其通过破坏arcA上游调控区而非完全敲除arcA来提升适应性。此外，fimE缺失菌株在pH 7条件下因促进菌毛表达而获得适应性优势，但在pH 4.5条件下其优势被yjjY插入菌株压制，揭示了环境依赖性适应度权衡。
讨论
本研究首次直接对比了转座子库短期进化与克隆长期进化的遗传结局，证实TraDIS技术可高效复现传统ALE识别的核心适应性基因（如arcA、fimE），同时发现大量LEE未能捕获的新靶点（如yjjY、sspA）。这些"独有基因"可能因适应性效应较弱、上位性相互作用或实验规模限制而未在LEE中固定。研究还强调了转座子插入效应的复杂性：除直接导致基因失活外，插入方向可能通过转录读通（如cad操纵子）、调控区破坏（如yjjY-arcA）或相变调控（如fimE）间接影响表型。尽管TSE无法检测增益性功能突变或多步进化路径，但其高通量特性使其成为探索多参数进化轨迹的理想工具，有望推动进化预测模型的发展。
材料与方法
实验使用大肠杆菌K-12 MG1655株，在非缓冲LB培养基（初始pH 4.5或7）中通过每日传代进行进化培养。转座子库通过电转EZ-Tn5转座子构建，TraDIS测序数据通过edgeR软件包分析基因富集情况。竞争实验采用lac-标记菌株KH001作为参照，通过麦康凯平板计数计算选择率（s）。全基因组测序由MicrobesNG完成，使用breseq流程进行突变鉴定。
