《ACS Sustainable Resource Management》：Advances and Challenges in Molar Mass Determination of Technical Lignins: Toward Robust Analytical Approaches
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本文是《技术木质素分子量测定：迈向稳健分析策略的进展与挑战》的编辑推荐。这篇综述聚焦于技术木质素（Technical Lignins, TLs）分子量准确测定的核心挑战与前沿策略，系统探讨了其因溶解性、聚集和自荧光等问题造成的分析困境。文章深入剖析了尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）、非对称流场流分离（Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation, AF4）等主流分离技术，以及多角度光散射（Multi-Angle Laser Light Scattering, MALS）、粘度、质谱等检测器的联用方案，并前瞻性地介绍了热场流分离（Thermal Field-Flow Fractionation, ThFFF）等新兴技术。综述特别强调了将分析精度与绿色化学原则相结合的重要性，为开发可重现、环保且可靠的木质素表征方法提供了清晰的路线图，对推动木质素在可持续生物经济中的高值化利用具有重要指导意义。
木质素是维管植物细胞壁中含量第二丰富的生物聚合物，是支撑植物结构、促进水分运输和保护多糖免受降解的关键组分。然而，从木质纤维素生物质中提取木质素通常需要使用苛刻的方法，这会改变其化学结构，所得产物被称为“技术木质素”（Technical Lignins, TLs）。TLs传统上被视为废弃物，但其作为可再生资源在抗氧化、抗真菌、抗生素以及表面活性剂、分散剂、药物、电化学材料和3D打印等领域具有广泛应用潜力。TLs的结构性质和潜在应用高度依赖于其分离工艺（如硫酸盐法、亚硫酸盐法、有机溶剂法、蒸汽爆破法等），因此，全面了解所回收聚合物的分子参数至关重要。其中，分子量及其分布是决定聚合物材料性能、理解大分子结构和组成的关键参数，直接影响其理化特性。
准确测定木质素的分子量对其高值化和最终融入可持续价值链至关重要。然而，TLs的分子量测定面临三大核心挑战：溶解性、聚集/缔合效应和自荧光。这些挑战阻碍了其稳健的分析表征。
溶解性挑战与应对策略
木质素由酚类和芳香族结构组成，富含甲氧基、羟基和烷基侧链等官能团，整体呈疏水性，在水中的溶解性差。其完全溶解对于获得可靠的分子量读数至关重要，以确保结果基于孤立的大分子，而非它们之间的进一步相互作用。研究表明，Dowanol PM（1-甲氧基-2-丙醇）、丁基卡必醇（二甘醇单丁醚）和二甲基亚砜（DMSO）等极性溶剂对硫酸盐木质素（KL）和硬木有机溶剂木质素（OL）的溶解性较好（>80%）。离子液体（ILs）和低共熔溶剂（DESs）在溶解木质素方面也显示出巨大潜力。二元溶剂体系（如DMSO/水、二噁烷/水）可成功实现多种TLs的完全溶解，且因包含水而更符合绿色化学原则。此外，通过添加盐（如LiBr）或表面活性剂、调节pH值，或对木质素进行乙酰化、乙酰溴化、甲基化等化学衍生化，也是改善其溶解性的常用策略。然而，这些方法各有优缺点，例如衍生化反应可能不完全，导致分子量测定不准确；而ILs和DESs可能存在粘度高、成本昂贵、与检测器兼容性差等问题。
聚集/缔合效应及其调控
木质素在分析过程中的聚集会严重影响分子量信息的可靠性。分子间和分子内相互作用，如氢键、π-π相互作用、范德华力和链缠结，都会导致木质素大分子的缔合。溶剂的选择、pH值、温度和离子强度是影响聚集的关键参数。极性非质子溶剂（如DMSO或DMF）可通过破坏木质素-木质素氢键来减少聚集。降低pH值会显著降低木质素的电荷，最终导致絮凝。添加盐（如氯化钠、氯化锂）有助于破坏聚合物和蛋白质中的分子间和分子内氢键，从而减少聚集。衍生化（如乙酰化）通过移除羟基也能减少氢键和聚集。系统性地调控这些参数，对于最小化缔合效应、获得真实的分子量分布信息至关重要。
自荧光问题与硬件解决方案
木质素的自荧光特性对其分子量准确测定干扰很大，主要影响基于光散射的检测技术。自荧光可能源于苯基香豆素和芪等结构，其发射波长范围在240-600 nm，激发最大值在360-465 nm，具体取决于木质素的结构。聚集诱导发射也在木质素的复杂荧光特性中扮演角色。为尽量减少自荧光对分子量测定的影响，已发展出多种硬件策略：一是在标准MALS检测器的光电二极管前安装荧光带通滤光片，以阻挡样品产生的特定荧光；二是使用红外激光（>700 nm，如785 nm）的MALS检测器，该波长超出了木质素的主要激发范围，从而减少了荧光和吸收的贡献。这些改进显著提高了基于光散射的绝对分子量测定结果的可靠性。
用于分子量测定的尺寸分离技术
尺寸分离技术主要分为柱基法和通道基法，其中尺寸排阻色谱（SEC）和场流分离（FFF）最为常用。
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尺寸排阻色谱（SEC）： SEC是最主要的木质素分子量分析技术，基于大分子的流体力学体积进行分离。其优点包括易用、样品处理速度快、所需样品量少、检测分子量范围宽。然而，SEC的准确性受到校准标准的限制。使用聚苯乙烯（PS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等常规标准品进行校准，会因木质素支化结构更紧密、与溶剂相互作用不同而导致分子量计算不可靠。通用校准（需联用粘度检测器）可得到更接近绝对分子量的值，但对于高度支化的结构仍可能出现偏差。此外，分析物与固定相之间的吸附作用等非尺寸排阻效应也会影响洗脱行为。因此，选择惰性固定相、优化溶剂体系对于获得准确结果至关重要。
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场流分离（FFF）： 非对称流场流分离（AF4）是SEC的有力补充。由于没有固定相，AF4消除了非尺寸排阻效应，并能分离更宽的分子量范围。其分离机制是在施加交叉流的开放通道中，基于样品的扩散系数进行分离。AF4系统常与MALS、RI、UV和粘度检测器联用。然而，AF4通道使用的膜材料（如纤维素、聚醚砜）限制了其流动相主要为水性溶液，这使得它对于多数需要苛刻有机溶剂溶解的TLs类型应用有限。热场流分离（ThFFF）是FFF家族的另一成员，利用通道壁间的温度梯度进行分离。其优势在于可使用有机溶剂，且洗脱可通过调整热场强度来获得基于尺寸和化学组成的分离，为木质素分析提供了新的可能，但目前尚未见应用于木质素的报道。
联用于分离技术的检测器
无论采用何种分离技术，检测器对于计算正确的分子量都至关重要。
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粘度检测器： 在线粘度检测通过通用校准，在SEC中用于测定更接近真实值的分子量。粘度数据还可用于计算特性粘度，并进一步通过Flory-Fox关系式转换为粘度半径（Rη），从而获得小尺寸分子的信息。通过Mark-Houwink方程（[η] = KMa）中的a指数，可以了解聚合物在溶液中的构象。对于木质素，a值通常在0.17-0.35之间，证实了其高度支化大分子所具有的紧密结构。
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光散射检测器： 多角度光散射（MALS）检测器与浓度检测器（如RI）联用，可直接测定绝对分子量和旋转半径（Rg，要求尺寸大于约20-30 nm）。其计算依赖于折射率增量（dn/dc）和浓度信号。如前述，木质素的自荧光会严重干扰MALS信号。为此，采用了荧光滤光片和红外激光（785 nm）两种主要策略来克服这一挑战。红外激光MALS能有效减少荧光贡献，无需滤光片，为木质素绝对分子量测定提供了更可靠的解决方案。
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质谱（MS）： 质谱是一种绝对分子量检测技术，可提供样品的结构、纯度和组成信息。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）是最常用于聚合物分析的“软”电离技术，具有高灵敏度，可区分精细结构。对于木质素，MALDI-ToF MS已成功用于测量低于1000 m/z的低分子量组分（寡聚体）。但由于木质素的复杂性和异质性，高分子量组分的分析仍面临离子化效率和质量歧视等挑战。使用离子液体基质等新方法显示出分析更高分子量组分的潜力。
结论与可持续性展望
在开发全面表征木质素的分析技术方面已取得巨大进展，但溶解性有限、聚集和自荧光等挑战仍然存在，常常需要通过结构修饰来应对。SEC因其广泛的分子量分离范围仍是目前最有前景的分离技术，而AF4则受限于溶剂体系。未来研究需要关注ThFFF等替代分离技术。ThFFF结合对自荧光不敏感的红外激光光散射和粘度检测，有潜力同时提供木质素的绝对分子量、化学组成分布等信息。
在追求分析精度的同时，必须同等关注所采用分析方法的可持续性。当前的分析工作流程通常依赖于大量溶剂和试剂，仪器本身也具显著的环境足迹。在溶解环节，应优先考虑使用可生物降解的绿色溶剂（如DMSO、2-甲基四氢呋喃）。在必须衍生化时，需选择环境友好的衍生化方法。在分离技术方面，虽然SEC和AF4都需要仪器平衡和流动相，但AF4的交叉流机制会持续将溶剂推过半透膜，从而增加总溶剂消耗量。相比之下，ThFFF依赖温度梯度进行分离，所需流动相流速低，溶剂消耗量最少，是目前所述方法中溶剂效率最高的。采用多检测器设置（如将SEC或AF4与UV、RI、荧光、MALS和粘度检测器联用）是一种战略性进步，它能够从单次进样中同时获取分子量分布、尺寸分布、构象、支化度和荧光数据，符合绿色化学的废物预防和能源效率原则，减少了进样次数、试剂和溶剂用量。
木质素分子量测定的发展极大地推动了MALS检测器的改进以减少荧光干扰。在分析开始前，盐添加剂已被证明可以改善溶解性并抑制聚集，且不改变木质素结构。将分析精度与绿色化学原则相结合，是开发可重现、环保且可靠的木质素表征方法、推动其迈向循环、碳基经济的关键。
