《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Recent advances in bacterial detection techniques targeting genetic, protein, and enzymatic biomarkers
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本综述系统梳理了基于遗传（PCR/CRISPR/dPCR/LAMP/mNGS）、蛋白质（免疫测定/适配体/抗菌肽/噬菌体）和酶（β-内酰胺酶/脲酶/过氧化氢酶/β-半乳糖苷酶）三类生物标志物的细菌检测技术进展，比较了其检测限（LOD）、检测时间、现场应用（POCT）和药敏试验（AST）性能，并展望了多模式工作流程、智能材料与现场快速诊断（POCT）设备的融合发展趋势。
1. 引言
快速准确的细菌检测对于临床诊疗、食品安全及环境监测至关重要。传统培养法耗时（24–72小时）且难以满足即时检测（POCT）需求。近年来，针对细菌特异性生物标志物的检测技术取得显著进展，主要聚焦三大类标志物：遗传标志物（如DNA/RNA序列）、蛋白质标志物（如表面抗原、毒素）和酶生物标志物（如代谢或毒力相关酶活性）。这些技术通过不同机制实现细菌的灵敏、特异及快速检测，并在转化应用方面展现出巨大潜力。
2. 细菌检测技术进展
2.1. 靶向遗传标志物的检测技术
2.1.1. 基于核酸扩增（NAA）和测序的技术
分子检测通过靶向细菌独特的DNA或RNA序列（如16S rRNA基因）实现高灵敏度和特异性。聚合酶链式反应（PCR）通过热循环变性、退火、延伸扩增目标序列，其变体如实时定量PCR（qPCR）可实现实时监测和定量。数字PCR（dPCR）将样本分区进行绝对定量，对低载量感染或罕见耐药基因检测具有优势。环介导等温扩增（LAMP）在恒定温度下进行扩增，无需热循环设备，适合现场检测。下一代测序（NGS）技术，特别是宏基因组测序（mNGS），无需培养即可对样本中全部遗传物质进行高通量测序，能同时鉴定细菌、病毒、真菌及寄生虫，并提供耐药基因谱信息。
2.1.2. 基于信号放大的技术
此类技术通过“识别-放大-转导”模式将极低拷贝的细菌基因信号转化为可检测的宏观读数。CRISPR-Cas系统（如Cas12a、Cas13a）在crRNA引导下特异性识别靶标后，可非特异性切割报告探针，产生荧光、比色等信号，灵敏度极高。核酸外切酶III（Exo III）可消化双链DNA，用于信号放大。脱氧核酶（DNAzyme）是具有催化活性的DNA分子，可设计用于特异性检测。纳米传感器（如金纳米颗粒AuNPs）通过聚集/分散产生颜色变化或借助微流控等技术实现超灵敏检测。这些技术普遍具有检测快速、操作简便、适合POCT等优点。
2.2. 靶向蛋白质生物标志物的检测技术
2.2.1. 基于抗体的免疫测定
酶联免疫吸附试验（ELISA）基于抗原-抗体特异性结合，通过酶催化底物产生信号进行检测，具有高特异性。侧向流动免疫分析（LFIA）试纸条利用样本毛细作用移动，与标记抗体结合后在检测线富集产生可见信号，适合POCT。其他高级生物传感器将抗体与荧光、磁性、电化学等信号转导方式结合，进一步提升性能。
2.2.2. 基于适配体的检测技术
适配体是通过SELEX技术筛选出的单链DNA或RNA分子，可高亲和力、高特异性结合靶标（如细菌表面蛋白）。与抗体相比，适配体具有合成成本低、稳定性好、易于修饰等优势。基于适配体的传感器包括荧光传感器（结合荧光基团/淬灭基团）、比色传感器（如AuNPs颜色变化）、电化学传感器（通过电极表面阻抗/电流变化检测）和表面增强拉曼散射（SERS）传感器（提供分子指纹图谱）等。
2.2.3. 基于抗菌肽（AMPs）的蛋白质生物标志物检测
抗菌肽是天然存在的短肽，对细菌膜具有天然亲和力，可识别细菌表面相关蛋白，作为识别元件用于检测。
2.2.4. 基于噬菌体的蛋白质生物标志物检测
噬菌体是特异性感染细菌的病毒，其尾丝或受体结合蛋白（RBPs）可高选择性识别并结合细菌表面受体，用于构建特异性生物传感器。
2.2.5. 基于蛋白质谱的蛋白质生物标志物检测
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）通过分析细菌（主要是核糖体蛋白）的蛋白谱图，生成物种特异性谱图，与数据库比对实现快速鉴定。
2.2.6. 基于识别元件的全细胞生物传感器
此类传感器将抗体、适配体、肽或噬菌体蛋白等识别元件固定在传感平台上，细菌结合事件通过质量变化、折射率变化或电阻抗等物理信号被转导和测量。分子印迹聚合物（MIPs）也可用于制备高选择性识别细菌的传感器。
2.3. 靶向酶生物标志物的检测技术
2.3.1. 基于β-内酰胺酶的检测方法
β-内酰胺酶可水解β-内酰胺类抗生素（如青霉素）。使用硝基西芬等显色底物，可在细菌存在时发生颜色变化（如黄变红），快速推断β-内酰胺类抗生素耐药性。更灵敏的生物发光探针等方法也被开发出来。
2.3.2. 基于脲酶的检测方法
脲酶可分解尿素产氨，导致pH值升高。快速脲酶试验利用pH敏感染料颜色变化检测幽门螺杆菌等产脲酶细菌。荧光聚合物颗粒等方法可定量检测脲酶活性。
2.3.3. 基于过氧化氢酶的检测方法
过氧化氢酶可分解H2O2产生气泡，是经典的鉴定试验。基于此原理的等离子体纳米传感器、化学发光纳米传感器等可用于快速检测产过氧化氢酶细菌及其抗生素敏感性。
2.3.4. 基于β-半乳糖苷酶的检测方法
β-半乳糖苷酶主要存在于大肠杆菌等肠杆菌科细菌中，可水解特定合成底物（如CRPG、PAPG）产生颜色变化或影响纳米材料催化活性，用于检测大肠菌群。
2.3.5. 其他用于细菌检测的酶测定法
氧化酶试验、吲哚试验等经典酶学试验也常用于细菌鉴定，具有快速、直观的特点。
3. 结论与展望
靶向遗传、蛋白质和酶生物标志物的细菌检测技术各具特色：遗传学方法灵敏度高、特异性强；蛋白质学方法速度快、易于实现POCT；酶学方法能反映细菌活性和功能。未来发展趋势包括：提高检测速度和便携性（如CRISPR试纸条、便携测序仪）；增强多重检测能力（如微阵列、多重PCR/CRISPR）；提升灵敏度至单细胞/单分子水平（如dPCR、超灵敏电化学适配体传感器）；开发智能材料增强特异性；以及整合多模式工作流程（如LFA结合等温扩增、适配体捕获结合芯片PCR）以克服单一技术的局限性。与微流控、Lab-on-a-chip系统、数字读出和智能手机接口的集成，将进一步推动细菌诊断技术在临床、食品安全和环境监测领域的即时、精准和广泛应用。
