《The FEBS Journal》：Anti-cancer drugs targeting the NADH-binding site of VDAC rewire channel electrophysiology and partially suppress cation selectivity
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本文系统研究了五种靶向线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC）NADH结合口袋的小分子化合物（VA药物）的电生理学效应。通过平面脂双层技术，作者发现这些药物可显著减弱hVDAC1的电压依赖性门控，促使其在较高膜电位下仍稳定于开放构象，并部分逆转通道在关闭状态下对阳离子的选择性偏好。该工作为理解VDAC靶向药物通过调控线粒体代谢流发挥抗肿瘤作用的分子机制提供了重要见解，为开发新型抗癌疗法奠定了基础。
引言：VDAC1——线粒体与细胞代谢的门户
位于线粒体外膜的VDAC1是控制线粒体与细胞质之间离子、呼吸底物、ATP、ADP交换的关键蛋白质。在细胞命运决定中的核心作用使其成为癌症研究中一个极具前景的靶点。近期，一个高度保守且具有成药潜力的NADH样结合口袋的发现，催生了一系列具有潜在抗肿瘤活性的特异性VDAC拮抗剂。然而，这些药物如何影响VDAC离子通道特性及其通透性调控，此前尚未阐明。
结果：VA药物如何重塑hVDAC1的电生理特性
β-NADH降低低膜电位下hVDAC1的电导
首先，研究者在平面脂双层中评估了VDAC1的天然调节剂β-NADH的效应，为后续VA药物的测量提供基线。实验表明，15 μM β-NADH显著降低了嵌入脂双层中的单hVDAC1孔道的电导。结合口袋被β-NADH占据后，还能阻止通道在通常诱导孔道向低电导状态转变的膜电压下关闭，同时增加了电流噪音。值得注意的是，β-NADH处理后的hVDAC1在所有测试电压下均保持了对阳离子的长期选择性偏好。
VA药物不影响通道的高电导开放状态
研究确认，所测试的VA分子（20 μM）和溶剂DMSO均不影响平面脂双层的稳定性。在对称1 M KCl溶液中，于±10 mV恒定电压下，五种VA药物（VA-D11, VA-D10, VA-C1, VA-C4, VA-C6）的添加均未显著改变hVDAC1在低膜电位下的高电导开放状态的平均电导值。这表明靶向VDAC1 NADH结合位点的分子在低膜电位下不影响通道的最大电导。
VA药物损害人VDAC1的电压响应
VDAC对离子和代谢物的通透性动态响应膜电位的变化。应用幅度大于±30 mV的电位会诱导通道向多个电导大幅下降的关闭状态转变。为了研究VA分子对通道电压门控的影响，研究对重构于人工膜中的人重组VDAC1施加了±50 mV的三角波电压。结果显示，未处理的hVDAC1在±20–30 mV时稳定地从开放态转变为关闭态。而每种VDAC拮抗剂的添加都将通道关闭的电压阈值提高至±30 mV以上，并诱导通道活动在正负施加电压下均出现快速的闪烁/亚态间转换。所有五种分子都降低了钟形曲线的陡度，即减弱了电压依赖性，其中D11和C1分别在负压或正压下引起了更大的电压响应损失。VA药物引起的hVDAC1电压依赖性降低百分比约为25%至32%不等，表明它们通过削弱蛋白质对膜电位的敏感性直接干扰了孔道的门控机制。相比之下，β-NADH将通道维持在持续的低电导状态，未表现出电压依赖性门控的变化。
VA药物迫使hVDAC1即使在高电压下也保持开放状态
开放概率的计算显示，每种VA药物都导致hVDAC1的开放概率曲线变得不如未处理时陡峭。与VA分子存在时，hVDAC1从开放态向关闭态转变的电压值显著升高。值得注意的是，VA-D11和VA-D10将V0提高到大于±30 mV的值，而VA-C1、VA-C4和VA-C6则将其提高到超过±35 mV。在通常使通道转变为稳定低电导状态的高电位下，每种小分子都将VDAC1转变为不同的亚关闭态，这些状态的特征是电导值高于未处理时的关闭态。同时，VA分子增加了在理应降低开放态的电压下对应apo-hVDAC1开放态的计数。然而，尽管VA-D11、VA-D10、VA-C1和VA-C4即使在±50 mV的膜电位下也改变了线粒体孔道的动力学，但VA-C6在高于±40 mV的电压下保持了hVDAC1的电压响应不变。对开放态停留时间的分析进一步支持了这些分子促进hVDAC1开放并破坏高施加电压下通道稳定性的趋势。线性回归分析在更大程度上证明了测试分子对通道的调节作用。具体而言，在VA药物存在下，回归线向上移动，表明开放态稳定性增强。特别是，VA-D11、VA-D10和VA-C4诱导斜率相对于未处理对照增加了约0.01–0.04个单位。VA-C1导致正负电位下的斜率均发生变化，表明该分子在维持通道开放态方面能力更强，即使在高电压下也是如此。相反，尽管VA-C6改变了斜率，但其停留时间值与apo-hVDAC1在-40和±50 mV时的值无显著差异。
VA药物部分抑制重组人VDAC1的阳离子选择性
VDAC1在“开放态”表现出对阴离子略高于阳离子的偏好，而“关闭态”则有利于包括Na+、K+、Ca2+在内的阳离子的非选择性渗透。本研究在不对称KCl浓度条件下，探索了人重组VDAC1在平面脂双层中的离子选择性。在这些实验条件下，apo-hVDAC1在开放态表现出典型的阴离子选择性，在关闭态则表现出轻微的阳离子偏好。将VA分子添加到重构的hVDAC1中，导致了通道选择性的极端改变，其特征是在低膜电位下阴离子选择性增加24%至36%，而在高膜电位下阳离子偏好丧失55%至67%。
讨论：VA药物抗肿瘤作用的潜在机制
肿瘤细胞通过增强有氧糖酵解和增加葡萄糖摄取来下调氧化磷酸化，从而获得增殖优势。VDAC1作为线粒体能量代谢的主要调节者，积极维持癌症的能量重编程，是抗肿瘤治疗的一个新兴靶点。然而，迄今为止开发的大多数作用于VDAC的潜在药物都因缺乏对线粒体孔蛋白的特异性和共同结构基序而导致高毒性，不适合临床试验。近期针对VDAC1 NADH结合口袋设计的小分子已被证明是选择性杀死恶性细胞的一个转折点。基于在培养的癌细胞和活体类器官中观察到的有前景的抗增殖效果，有人提出这些药物可能作为精确的“VDAC开放剂”，通过增加代谢物跨通道的流量和胞质ATP/ADP比率来对抗线粒体代谢的部分抑制，最终有助于抑制糖酵解。为验证这一假设，本研究探索了五种新型VDAC靶向小分子对人VDAC1电生理特性的影响。
研究结果表明，一旦添加到含有hVDAC1的平面脂膜两侧，所测试的药物均不影响通道的高电导开放态，该状态在整个记录时间内保持稳定。相反，孔道的电压依赖性显著受损。大多数分子将孔道关闭延迟到高于±30 mV的电位。从单一开放态向多个关闭态的转变并不尖锐，几乎所有药物都导致hVDAC1在两个或多个电导水平之间持续波动。因此，在测试分子存在下，单个通道随跨膜电位变化的开放概率统计上有所增加。然而，VA药物并非均匀地影响通道的电压依赖性。这仍然是一个未解决的问题，需要进一步研究，考虑到所有VA分子对通道的亲和力相当。一种可能的解释是，除了共同的三环结构外，其原子取代基的差异影响了它们的动力学行为和结合动态。hVDAC1门控行为的变化表明，这些化合物专门干扰电压响应，因为它们降低了关闭频率，并迫使通道即使在高电位下也保持开放，而没有扰乱低电压下的最大电导状态。很明显，尽管与β-NADH结合口袋共享部分区域，但这五种VA分子调节hVDAC1电生理的方式与β-NADH本身不同。与Colombini及其同事的发现相反，我们的结果表明β-NADH在±10 mV施加电压下就已经降低了hVDAC1的电导，并将通道冻结在持续的低电导状态。这些差异背后的原理可能与文献中使用的hVDAC1其N端前10个氨基酸被酵母同源物的前9个残基所取代有关。最近，Hiller及其同事将β-NADH结合触发的孔道电导下降完全归因于对阴离子流的空间阻塞，这是一种与门控过程分离的机制。在这方面，必须强调的是，除了分子质量的实质性差异外，残基N238，特别是K236——负责与VDAC靶向分子的L环建立阳离子-π相互作用——对于β-NADH的结合并非必需。值得注意的是，据报道K236参与与位于N端部分的残基F18的主链形成氢键，因此可以推断我们的药物干扰了α螺旋的运动，而该运动是通道响应电压升高进行调节所必需的。K236和N238也被确定为抗心律失常化合物efsevin与斑马鱼VDAC2 β桶内壁相互作用的关键锚定残基。然而，与VA分子不同，efsevin的结合促进了通道关闭而非阻碍关闭，这可能是由于zVDAC2与hVDAC1识别位点周围氨基酸序列的差异以及药物化学结构的不同所致。目前尚无关于efsevin对肿瘤细胞影响的数据。
如果迄今为止描述的结果反映了最初的假设，即VDAC靶向分子通过抵抗电压诱导的关闭，有效地将hVDAC1维持在开放构型，那么离子选择性测量则首次证明，VDAC拮抗剂通过“重新激活”线粒体代谢，增加阴离子代谢物进出线粒体的通量，从而对癌细胞发挥抗增殖活性。相应地，VA-D10、VA-D11、VA-C1、VA-C4和VA-C6增强了开放态的阴离子通透性，同时显著抑制了孔道在关闭态对带正电离子的偏好。与此截然相反，β-NADH将孔道维持在电压不敏感状态，并赋予其比apo-hVDAC1更显著的阳离子选择性。这些最新数据具有特别的相关性，因为VDAC1与肌醇1,4,5-三磷酸受体和葡萄糖调节蛋白75一起，在线粒体-内质网接触位点介导线粒体Ca2+摄取，这已被证明对于维持许多肿瘤细胞系中OXPHOS和ATP产生的基础水平至关重要。引人注目的是，通过抑制IP3R活性来关闭组成性内质网向线粒体的Ca2+转移，与生物能量危机相关，最终导致人原代成纤维细胞以及肿瘤性乳腺和前列腺细胞系中AMPK依赖性和mTOR非依赖性自噬的激活。然而，虽然非肿瘤性细胞通过限制其进入细胞周期来减缓增殖，但癌细胞对Ca2+极其敏感，因为它们不会响应AMPK激活而阻滞细胞周期，并在胞质分裂期间发生坏死。因此，减少对阳离子的渗透可能是VA分子对癌细胞具有选择性致死作用的基石机制。除此之外，必须考虑到VDAC开放是一把双刃剑：虽然它促进了阴离子代谢物的运输，但同时增加了ROS的产生。这反过来又驱动氧化应激诱导的线粒体功能障碍和生物能量衰竭，最终导致细胞死亡。根据Maldonado及其同事的研究，erastin和erastin类似化合物确实通过逆转微管蛋白对VDAC的阻塞状态来触发恶性细胞中的铁死亡，该状态限制了呼吸底物的进入并降低了线粒体膜电位。这可以解释为什么如文献中报道的，用VA分子处理48小时会选择性地损害过表达VDAC1的癌细胞中的线粒体呼吸，但对正常细胞没有影响。很可能是由于VDAC开放最初刺激线粒体生物能量学导致的ROS慢性积累，最终引发了线粒体崩溃。基于这些考虑，本工作中利用的生物物理学方法增进了对VDAC靶向化合物抗肿瘤活性的理解，这种活性很可能归因于由不符合常规的VDAC门控驱动的多种细胞改变共同导致癌细胞死亡。仍然需要深入的研究来全面描述VA分子引起的代谢变化，并优化其化学结构，以期未来作为癌症治疗药物应用。
结论：靶向VDAC1对抗肿瘤生物能量学的新策略
总之，本研究提出了VDAC靶向小分子选择性抗肿瘤活性的潜在机制。通过稳定VDAC1的开放状态并阻止电压依赖性关闭，这些化合物充当“VDAC开放剂”，增强阴离子通透性，同时限制阳离子流动。这种双重调节可能既重新激活了癌细胞中的线粒体代谢——其中氧化应激的逐渐积累最终会损伤线粒体并促进细胞死亡——又降低了VDAC1的阳离子通透性，推测会损害维持OXPHOS所需的内质网向线粒体的Ca2+流。然而，需要更多的研究来进一步明确构效关系并优化这些化合物的药理学特性。总体而言，本研究强化了将VDAC1作为破坏肿瘤生物能量学和增殖策略的理论基础。
