分离方法对犬成骨细胞与骨肉瘤细胞胞外囊泡糖基化模式的差异性影响研究

《Journal of Extracellular Biology》：Separation Methods Affect Glycan Patterns in Extracellular Vesicle Preparations From Canine Osteoblasts and Osteosarcoma Cells

本文系统比较超速离心(UC)、尺寸排阻色谱(SEC)和商品化沉淀试剂盒(TEI)三种分离方法对犬骨肉瘤细胞(D-17)与正常成骨细胞(CnOb)胞外囊泡(EV)糖基化模式的影响。研究发现分离方法会显著改变EV蛋白糖基化特征，其中SEC法在CnOb-EV中检测到独特的45kDa糖蛋白，而骨肉瘤细胞及其EVs均呈现糖蛋白相对减少趋势。该研究为肿瘤EV糖基化生物学功能研究和分离方法标准化提供了重要依据。

　　

分离方法对胞外囊泡糖基化模式的影响机制

引言

骨肉瘤(OS)作为人类和犬类最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有高度转移特性和不良预后特征。近年来，胞外囊泡(EV)作为肿瘤微环境的关键信使，其表面糖基化模式通过影响囊泡附着、摄取等过程参与肿瘤转移调控。本研究首次系统比较超速离心(UC)、尺寸排阻色谱(SEC)和总外泌体分离试剂盒(TEI)三种方法对犬骨肉瘤细胞(D-17)与正常成骨细胞(CnOb)来源EV糖基化谱的影响。

材料与方法

实验采用EV-TRACK平台确保研究可重复性。通过无血清培养48小时获取条件培养基，分别采用三种方法分离EV：UC法经梯度离心后100,000×g超离2小时；SEC法使用qEV1 35nm色谱柱分离；TEI法按试剂盒比例沉淀过夜。通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、蛋白质印迹、凝集素印迹（12种凝集素包括Con A、RCA、WGA等）和透射电镜(TEM)对EV进行多维度表征。

结果

1. 1.
   EV分离方法显著影响颗粒特性：UC法获得最小粒径颗粒（D-17: 110.1nm，CnOb: 149.0nm），TEI法颗粒最大且易聚集。SEC法制备的CnOb-EV在电镜下呈现特殊致密结构，可能与其表面糖基化修饰相关。
2. 2.
   糖基化模式呈现方法依赖性：SEC法在CnOb-EV中特异性检测到45kDa强糖基化蛋白，该蛋白在UC和TEI制备物中缺失。凝集素印迹显示UC与TEI模式相似，而SEC法显著增强CnOb-EV中半乳糖/N-乙酰半乳糖胺(ECL检测)等糖链信号。
3. 3.
   肿瘤EV糖基化特征：D-17细胞及其EVs相比CnOb呈现整体糖基化水平降低，其中岩藻糖(LCA/PSA检测)和N-乙酰乳糖胺(RCA I检测)在EV中显著富集，而唾液酸(MAL I/SNA检测)在CnOb细胞中表达更高。

讨论

本研究揭示EV分离方法会选择性富集特定糖基化亚群：SEC法可能更好保留天然糖链结构，而TEI法因共沉淀导致背景噪音。值得注意的是，骨肉瘤EV中普遍降低的糖基化水平可能通过减少免疫识别（如唾液酸-Siglec相互作用）促进靶细胞摄取，这为解释肿瘤EV的转移优势提供了新视角。未来需结合功能实验验证不同糖型EV的生物学行为差异。

结论

三种EV分离方法产生具有显著差异的糖基化谱，其中SEC法在检测疾病特异性糖蛋白方面展现优势。犬骨肉瘤EV的低糖基化特征可能成为新的诊断标志物和治疗靶点，本研究为标准化EV分离流程和糖生物学研究提供了重要技术参考。