《Scientia Horticulturae》：SSR and ddRADseq genotyping to discriminate and protect an Italian white-type celery (
Apium graveolens L.) landrace
编辑推荐：
本研究针对意大利白芹地方品种“Bianco di Sperlonga”（BS）缺乏有效遗传鉴定工具、面临遗传侵蚀风险的问题，研究人员开展了利用SSR和ddRADseq技术进行基因分型的主题研究。结果成功揭示了BS品种的高遗传相似性（≥98.5%）和近交遗传结构，开发出可区分BS的特异性PCR分子标记（BS9CTGT和BS10T），为PGI产品的真实性认证和种质资源保护提供了重要分子工具。
在意大利丰富的农业生物多样性宝库中，地方品种（landrace）占据着举足轻重的地位。它们经过长期的自然选择和人工驯化，形成了对当地环境独特的适应性和优异的风味品质。芹菜（Apium graveolensL.）作为意大利重要的蔬菜作物，拥有多个具有地域特色的地方品种，其中来自拉齐奥（Lazio）地区的白芹“Bianco di Sperlonga”（BS）因其独特品质而被列为受保护的地理标志（PGI）产品。然而，与已被深入研究的“Nero di Trevi”（NT）和“Dorato d’Asti”（SA）等地方品种不同，BS长期以来缺乏系统的遗传评估。这使得其遗传独特性、与其他品种（尤其是同为白芹的SA）的界限变得模糊，为其真实性认证、市场保护以及防止品种混杂和欺诈带来了挑战。此外，芹菜作为一种典型的常异花授粉（allogamous）植物，其天然异交率约为70%，但传统农户自留种的繁殖方式可能通过严格的近交（inbreeding）导致遗传多样性丧失和遗传侵蚀（genetic erosion）风险。因此，厘清BS的遗传背景，开发快速、准确的鉴定技术，对于保护这一珍贵的农业遗传资源、维护PGI产品声誉以及实现可持续利用至关重要。为此，研究团队在《Scientia Horticulturae》上发表了他们的研究成果，旨在利用现代分子标记技术揭示BS的遗传奥秘。
为达成研究目标，研究人员整合运用了多种关键技术。他们首先构建了一个包含19个芹菜种质（含12个BS样本、其他白芹和黑芹地方品种及商业品种）的收集品，并从中采集叶片提取基因组DNA（gDNA）。研究核心采用了两种基因分型策略：一是基于表达序列标签的简单序列重复（EST-SSR）标记分析，选用了8个多态性位点；二是更为先进的ddRADseq（双酶切限制性关联DNA测序）技术，通过对基因组DNA进行MseI和ApeKI双酶切、建库，并在Illumina NovaSeq6000平台上进行双末端测序，随后将测序数据比对至芹菜参考基因组（ASM990537v1）进行单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（InDel）位点的 calling 与过滤，最终获得1330个高质量的双等位基因变异用于下游分析。数据分析涉及遗传多样性统计（如观察杂合度Ho、期望杂合度He、近交系数F、私有等位基因PA）、遗传相似性（GS）计算、主坐标分析（PCoA）、聚类分析（UPGMA）以及基于STRUCTURE软件的群体遗传结构分析。此外，基于ddRADseq识别出的BS私有等位基因，研究人员还开发了两种PCR为基础的分子标记（InDel-SCAR标记BS9CTGT和CAPS标记BS10T）并进行了验证。
3.1. SSR分析
通过SSR标记对芹菜收集品进行基因分型，共获得27个等位基因。分析显示，所有位点普遍存在观察杂合度（Ho）低于期望杂合度（He）的现象，表明杂合子缺失。BS各样本内部的遗传相似性（GS）极高（平均98.7%），部分样本内GS甚至达到100%。主坐标分析（PCoA）和聚类分析（UPGMA）将材料分为三个主要类群：一类包含所有BS和SA白芹地方品种，第二类包含所有商业品种（包括白芹和黑芹），第三类主要为黑芹地方品种NT。然而，SSR数据未能有效区分BS和SA这两个白芹地方品种。群体结构（STRUCTURE）分析（最佳K=12）显示BS样本呈混合状态，与多个祖先成分相关，但成员比例在不同BS样本间相似。
3.2. ddRAD数据集分析
ddRADseq分析获得了更高分辨率的基因型数据。遗传多样性统计再次确认了BS材料极低的杂合度（Ho平均0.05）和较高的近交系数（F平均0.16）。AMOVA（分子方差分析）表明，BS地方品种内部的遗传变异占97%，而不同BS样本间的变异仅占3%，基因流（Nm）高达7.2，说明BS各样本间遗传差异极小，近乎一个均匀的群体。与SSR结果不同，基于ddRAD数据的PCoA和STRUCTURE分析（最佳K=6）能够清晰地将BS与SA分开，BS样本几乎完全归属于一个独特的祖先成分（Ancestor 1，成员比例>95%）。此外，研究还鉴定出29个BS特有的私有等位基因（PA），为开发特异性标记奠定了基础。
3.3. 用于“Bianco di Sperlonga”芹菜地方品种诊断的分子标记开发
基于ddRADseq发现的BS私有等位基因，研究人员成功开发了两个PCR分子标记。BS9CTGT标记针对9号染色体上一个4 bp的插入，后续测序揭示其实际包含一个更大的263 bp的BS特异性插入。BS10T是一个CAPS标记，针对10号染色体上一个C到T的转换，该突变导致BfaI限制性内切酶酶切位点丢失。验证实验表明，这两个标记能有效区分BS和非BS样本（如SA、NT、商业品种等）。值得注意的是，在BS13样本中检测到BS10T标记的分离现象，提示该样本可能存在遗传混杂。
本研究通过SSR和ddRADseq两种技术，首次对意大利白芹地方品种“Bianco di Sperlonga”（BS）进行了系统的遗传评估。研究结果一致表明，BS地方品种具有极高的遗传相似性（≥98.5%）和明显的近交遗传结构（Ho < He，F为正值），这与芹菜作为常异花授粉作物的特性相悖，反而类似于自花授粉物种的遗传特征。这种独特的遗传结构被认为源于其可能的起源历史（由少量SA个体引种驯化而来）以及当地农户长期采用小群体留种繁殖的传统实践，导致了遗传瓶颈和遗传负荷的丢失，但通过选择保留了适应性。研究成功确立了BS相对于其他意大利芹菜地方品种（NT、SA）和商业品种的遗传独特性，特别是高分辨率的ddRADseq技术有力证实了BS与SA之间的遗传分化，支持了BS源于SA的推测。
更重要的是，本研究将基础研究成果转化为实际应用。基于基因组-wide的SNP/InDel信息开发的BS9CTGT和BS10T分子标记，为BS产品的真实性（authenticity）、追溯性（traceability）以及市场监管提供了低成本、易操作的分子工具，有助于保护PGI产品价值和防止食品欺诈。综上所述，该工作不仅增进了对芹菜地方品种遗传结构的理解，为种质资源保护策略（包括in situ和ex situ保护）提供了科学依据，而且为其他作物地方品种的遗传鉴定与保护提供了可借鉴的研究范式。
