表面增强拉曼光谱技术与支持向量机结合用于帕金森病的诊断

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Surface-enhanced Raman spectroscopy of serum exosomes coupled with support vector machine for diagnosis of Parkinson's disease

帕金森病诊断面临生物标志物缺乏和检测技术限制，本研究开发血清外泌体SERS结合SVM模型，经27种预处理策略验证，优化模型准确率0.85（AUC 0.85），显著优于MDS标准，并揭示“咖啡环”效应导致样本异质性，提出多后处理策略有效抑制该效应。

　　

刘欣然|魏新明|郑向翔|徐亮|吴国华|冯可可

天津工业大学电气工程与自动化学院，中国天津300384

摘要

帕金森病（PD）的诊断面临诸多挑战，这主要是由于缺乏可靠的生物标志物以及现有检测技术的局限性。外泌体携带反映疾病病理的生物分子，由于其在生物流体中的稳定存在以及可以通过微创方法获取，因此越来越被认为是有前景的生物标志物。表面增强拉曼光谱（SERS）具有高灵敏度和快速的分子指纹识别能力，但其临床应用受到光谱变化和样本异质性的限制。为了解决这些问题，我们开发了一种新的诊断方法，将血清外泌体SERS与支持向量机（SVM）分类相结合。对27种不同的数据预处理策略进行系统评估后确认，数据预处理对分类性能有重要影响；优化后的模型成功区分了PD患者和正常对照组（NC），准确率为0.85（95%置信区间[CI]，0.75–1.00），接收者操作特征曲线下面积（AUC）为0.85（95% CI，0.67–1.00），这一结果通过排列测试得到统计验证（p<0.05）。与运动障碍协会（MDS）的诊断标准相比，我们的模型表现更优。此外，本研究还发现“咖啡环”效应会引入样本异质性，从而显著降低重复性和预测准确性。我们实施了多种后处理策略来减轻“咖啡环”效应的影响，其中一种策略的结果与最优模型相当（AUC=0.85，准确率=0.85）。这表明此类后处理方法可以有效抑制“咖啡环”效应的影响。此外，线性SVM特征重要性映射识别出潜在的外泌体生物标志物，包括蛋白质（SS伸缩、色氨酸）、核酸（腺嘌呤振动、CH?/CH?扭转）、脂质和糖类）。总体而言，这些发现突显了结合基于外泌体的SERS和机器学习的临床PD诊断方法的前景，生物标志物的鉴定和异质性分析进一步提高了诊断的可靠性，为实际临床应用铺平了道路。

引言

帕金森病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍之一，全球患病人数估计为620万，每年约有117,400人死亡[1]。PD的神经病理学特征包括肌肉僵硬、震颤和步态异常。此外，还伴有自主功能障碍、尿失禁、幻觉和痴呆等非运动症状[2]、[3]、[4]。PD对人类健康构成重大威胁，因此其预防和治疗至关重要。

由于运动症状通常在不可逆的神经退行性病变发生后才会出现，PD研究中的一个关键挑战是建立可靠的无症状检测和早期诊断方法。目前的PD诊断主要依赖于临床症状（需要运动迟缓和至少另一个核心特征），而尽管多巴胺能示踪成像具有高特异性，但仅作为辅助工具[5]。这种以临床为导向的方法存在两个关键局限性：首先，运动症状通常在不可逆的神经退行性病变发生后才会出现；其次，缺乏用于早期检测病理变化的客观生物标志物[6]、[7]、[8]、[9]。因此，当前筛查技术的局限性凸显了开发新型PD诊断工具的迫切需求。

值得注意的是，拉曼散射技术具有快速、无创、无需标记物、无需试剂操作和样品制备简单的优势，为克服现有筛查方法的局限性提供了有希望的解决方案[11]、[12]、[13]。然而，其临床应用面临诸多挑战，包括自发的拉曼信号较弱以及生物样本的强荧光干扰[14]、[15]。因此，在生物研究中，表面增强拉曼散射（SERS）成为不可或缺的工具，因为它能够提供高灵敏度和分子结构信息[16]、[17]、[18]、[19]。SERS本质上是金属纳米结构中局部表面等离子体共振（LSPR）产生的纳米尺度效应，在金属表面产生显著增强的电磁场。拉曼信号的放大主要通过分析物分子的振动模式与LSPR诱导的电磁场之间的耦合实现，通常在适当的能量下通过金或银纳米结构在光学激发下产生[20]、[21]、[22]。最近，许多研究人员利用SERS对外泌体进行分析，用于诊断神经退行性疾病，包括重度抑郁症（MDD）和阿尔茨海默病（AD）[23]、[24]、[25]。

外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡（30–150 nm），携带蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子。外泌体在细胞间通信中起重要作用，将分子 cargo（包括伴侣蛋白、cDNA、核酸和mRNA）传递给邻近和远端细胞[26]。通过膜融合，外泌体将其蛋白质、脂质和细胞质内容物传递给受体细胞，从而调节目标细胞的生理和病理功能[27]、[28]。例如，外泌体的低免疫原性使其能够有效穿透血脑屏障（BBB）[29]。因此，外泌体在调节神经系统功能中起着关键作用。现有研究表明，血清外泌体具有潜在的PD诊断价值[2]、[30]。如上所述，结合血清外泌体和SERS可能为PD的临床诊断提供一种新方法。

重要的是，“咖啡环”效应可能会干扰生物流体的SERS光谱分析。这种现象是由液滴蒸发过程中的毛细流动引起的，它导致溶质颗粒（包括等离子体纳米颗粒和目标分子）从液滴中心迁移到边缘。在等离子体纳米传感器检测系统中，这种效应会导致纳米颗粒和分析物分子的分布不均匀[31]、[32]。Lin等人证明，在SERS分析过程中发生的“咖啡环”效应会导致测试样本中生化成分的分布不均匀。在血清样本的临床初步测试中，这种现象不仅显著降低了血液SERS技术的检测灵敏度和特异性，还对其高通量筛查的应用产生了不利影响[33]、[34]。“咖啡环”效应引起的非均匀分布可能导致样本异质性显著增加。然而，目前关于这种现象如何影响基于血清外泌体的PD检测可靠性的研究仍然有限，需要进一步探讨。

在这项研究中，我们开发了一种新的分类模型来区分PD患者和正常对照组（NC）。如图1所示，从10例PD患者和10例NC患者中收集了血清外泌体SERS光谱，每个样本收集了100个光谱。利用这些数据构建了一个基于机器学习的分类模型，并与运动障碍协会（MDS）建立的诊断标准进行了系统比较。重要的是，我们发现“咖啡环”效应引起的样本异质性显著降低了分类准确性，因此实施了多种后处理策略来减轻这种影响。此外，分析还识别出几种可能有助于改进PD诊断的潜在生物标志物。

部分摘录

血液采样

共收集了20份天津环湖医院的血清样本，包括10例PD患者和10例NC患者。图2展示了所有参与者的 demographic 特征，包括年龄和性别分布。该方案获得了天津环湖医院伦理委员会的批准（批准编号2025–268），并遵循赫尔辛基宣言进行。在样本收集前，所有参与者均签署了书面知情同意书。血液样本经过离心处理

血清外泌体样本的评估和检测

首先，通过超速离心法从血清样本中分离和纯化外泌体。使用NTA、TEM和WB对外泌体进行了表征（图3a和b）。图3a展示了PD患者的代表性样本的NTA和TEM结果，而NC患者的代表性样本的相关数据见图S1。NTA用于确定NC和PD患者代表性样本中外泌体的大小分布和浓度。

结论

总之，本研究提出了一种通过结合血清外泌体SERS和机器学习分析来检测PD的新方法。基于SVM的诊断模型在区分PD患者和NC患者方面的准确率为0.85，AUC为0.85，优于几种MDS临床标准，显示出其在早期筛查中的潜在适用性。重要的是，数据预处理策略和“咖啡环”效应引起的样本异质性都被发现显著影响了诊断结果

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号62475020）和中亚高发疾病发病机制、预防和治疗国家重点实验室基金（编号SKL-HIDCA-2024-14）的支持。