《Infection and Immunity》：Identification of novel pyrazolo[4,3-c]pyridine and diazepane derivatives as potent inhibitors of Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase B
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本研究通过结构导向虚拟筛选，鉴定出新型吡唑并[4,3-c]吡啶（pyrazolo[4,3-c]pyridine）与1,4-二氮杂?（1,4-diazepane）衍生物作为结核分枝杆菌蛋白酪氨酸磷酸酶B（PtpB-Mtb）的高效抑制剂。化合物D6与D9在酶学实验中分别表现出14.4 μM与32.6 μM的IC50值，并通过生物层干涉技术（BLI）验证其强结合力（Kd分别为0.012 μM与0.57 μM）。该研究为克服现有抑制剂选择性差、细胞渗透性低等难题提供了具有良好类药性质的新型先导化合物，为抗结核药物研发开辟了新途径。
ABSTRACT
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的一种严重传染病，是全球传染病致死的主要原因之一。多药耐药菌株的出现以及现有治疗方案疗程长（通常超过六个月）等问题，使得开发新型抗结核药物迫在眉睫。结核分枝杆菌蛋白酪氨酸磷酸酶B（Protein tyrosine phosphatase B, PtpB-Mtb）作为一个关键的毒力因子，因其独特的结构和功能特性，成为新型抗结核治疗的一个有前景的靶点。
本研究采用了一种全面的基于结构的虚拟筛选方法，旨在从化合物库中识别对PtpB-Mtb具有抑制潜力的新型小分子支架。研究团队对ChemBridge化合物库进行了筛选和过滤，保留具有类药性质的分子，随后通过分层分子对接和分子动力学模拟，优先筛选出与PtpB-Mtb活性位点具有高预测亲和力和稳定性的候选化合物。量子力学计算进一步表征了顶级候选化合物的电子性质。
研究人员表达并纯化了重组PtpB-Mtb蛋白，并通过体外酶学实验评估了候选化合物的抑制效力和选择性。结果发现，两个分别带有吡唑并[4,3-c]吡啶（pyrazolo[4,3-c]pyridine）和1,4-二氮杂?（1,4-diazepane）环状结构的衍生物对PtpB-Mtb活性表现出显著抑制，其IC50值分别为14.4 μM和32.6 μM。生物层干涉技术（Biolayer interferometry, BLI）证实了它们与PtpB-Mtb的强效特异性结合，解离常数（Kd）分别为0.012 μM和0.57 μM。
本研究提出的整合工作流程凸显了这些新型支架作为开发选择性、细胞渗透性PtpB-Mtb抑制剂起点的潜力，为下一代抗结核药物的发现提供了一条有前景的途径。
INTRODUCTION
结核病（TB）仍然是全球公共卫生和社会经济稳定面临的严峻挑战。漫长的治疗周期、日益严重的抗菌素耐药性以及潜伏感染的风险是有效控制结核病的主要挑战。结核分枝杆菌蛋白酪氨酸磷酸酶B（PtpB-Mtb）作为一种分泌型磷酸酶，在病原体于宿主巨噬细胞内的生存和复制中起着关键作用。它在结构上具有典型的磷酸酶折叠和保守的活性位点，与人类PTPs（如PTP1B）序列相似性低（<6%），这为选择性抑制提供了可能。PtpB-Mtb通过劫持宿主免疫反应（如抑制ERK1/2和p38介导的促炎细胞因子产生，激活Akt通路）以及破坏吞噬体成熟来促进细菌的胞内存活。遗传学研究表明，敲除ptpB基因会显著减弱Mtb在巨噬细胞和动物模型中的毒力，进一步验证了其作为药物靶点的价值。
然而，PtpB抑制剂的开发面临选择性、细胞渗透性以及体外活性向体内功效转化等多重挑战。许多早期抑制剂存在效力中等、选择性差、细胞膜穿透性不佳（尤其是一些依赖阴离子磷酸模拟基团的抑制剂）以及药代动力学性质不理想等问题。因此，开发兼具高亲和力、选择性、细胞渗透性和良好药理特性的新型支架仍然是寻找下一代PtpB-Mtb抑制剂的关键目标。
本研究旨在利用基于结构的虚拟筛选方法，识别和表征新型、选择性的PtpB-Mtb抑制剂。与许多已报道的磷酸酶抑制剂相比，本研究整合结构导向的虚拟筛选，旨在识别具有平衡理化性质的非阴离子杂环支架，以解决早期抑制剂的局限性。
MATERIALS AND METHODS
计算平台与软件
所有计算研究均使用Schr?dinger软件2024-1版本进行。
蛋白准备与活性位点定义
从蛋白质数据库（PDB ID: 2OZ5）获取了PtpB-Mtb与已知抑制剂OMTS复合物的X射线晶体结构。使用Schr?dinger套件中的Protein Preparation Wizard（PPW）进行蛋白准备，包括预处理、优化和能量最小化（使用OPLS4力场）步骤。活性位点围绕共结晶配体OMTS定义。
配体准备与虚拟筛选
从ChemBridge化合物库（约70万个分子）开始，使用LigPrep准备配体三维结构，并应用Lipinski五规则、反应性官能团排除和PAINS过滤器进行类药性过滤。采用Glide进行分层分子对接（高通量虚拟筛选HTVS、标准精度SP、额外精度XP模式），每阶段保留打分前5%的化合物。最终通过Prime MMGBSA方法计算结合自由能，并进行了回顾性富集分析以验证对接方案的可靠性。
分子描述符评估
使用QikProp模块评估了筛选出的先导化合物的关键药代动力学参数，如分子量、氢键供体/受体数、脂水分配系数（cLogP）、水溶性（LogSw）、总极性表面积（TPSA）和可旋转键数量。
分子动力学模拟
使用Desmond对顶级候选化合物D6和D9与PtpB的复合物进行了500 ns的分子动力学模拟，以评估复合物的稳定性、原子间相互作用以及配体结合对蛋白动态的影响。同时模拟了无配体的Apo蛋白作为对照。
量子力学计算
使用Jaguar模块，采用密度泛函理论（DFT，B3LYP杂化泛函，6-31G(d,p)基组）对配体D6和D9进行几何优化，并计算最高占据分子轨道（HOMO）、最低未占分子轨道（LUMO）、HOMO-LUMO能隙、平均局部电离能（ALIE）和静电势（ESP），以深入理解其电子特性和反应性。
重组蛋白生产与纯化
将pET28a-PtpB-Mtb载体转化至E. coliBL21(DE3)中表达带His标签的重组蛋白，通过镍柱亲和层析进行纯化，并使用对硝基苯磷酸酯（pNPP）作为底物验证其磷酸酶活性。
酶抑制实验
在96孔板中，将纯化的PtpB蛋白与待测化合物（50 μM）预孵育后，加入pNPP底物，于415 nm波长下检测吸光度，评估化合物对酶活的抑制率。
IC50与Ki测定
对抑制率超过60%的化合物进行剂量梯度实验，通过非线性回归拟合计算IC50值。通过Lineweaver-Burk图分析抑制类型，并根据竞争性抑制公式计算抑制常数（Ki）。
细胞毒性评估
使用MTT法在HEK293T细胞上评估先导化合物（D6和D9）的细胞毒性。细胞与不同浓度化合物孵育48或72小时后，加入MTT试剂，检测形成的甲臜晶体吸光度，计算细胞存活率。
生物层干涉技术动力学分析
使用Sartorius BLI Octet R4系统，通过Ni-NTA生物传感器固定His标签的PtpB蛋白，测量不同浓度抑制剂（0-100 μM）的结合与解离动力学，拟合得到解离常数（Kd）。
RESULTS
对接方案验证
通过将共晶配体OMTS重新对接到PtpB活性位点，计算其对接构象与晶体构象的均方根偏差（RMSD）为1.3397 ?，表明对接方案能准确重现结合模式。受体操作特征曲线（ROC）分析显示曲线下面积（AUC）为0.901，表明该对接方案能有效区分活性化合物与诱饵分子，具有良好的筛选能力。
虚拟筛选鉴定先导化合物
通过对ChemBridge库的虚拟筛选，基于对接打分和MMGBSA结合能，最终筛选出8个顶级候选化合物（D2, D3, D5-D10）。其中，化合物D9（24807456，1,4-二氮杂?衍生物）和D6（53747349，吡唑并[4,3-c]吡啶衍生物）因其独特的化学支架和良好的预测结合参数（D9对接打分-11.427 kcal/mol；D6 MMGBSA结合能-71.63 kcal/mol）而被重点关注。
先导化合物的ADME分析
使用QikProp对8个化合物的关键药代动力学参数进行评估。所有化合物分子量均在130-500 Da范围内，氢键供体（0-2）、受体（4-6）数符合Lipinski规则，TPSA值（45.67-95.66 ?2）和cLogP值（1.17-4.76）大多在理想范围内，水溶性和可旋转键数也显示良好的类药性。D6和D9的预测口服生物利用度在75%-85%之间，与一线抗结核药相当甚至更具优势（如适中的脂溶性可能有利于组织穿透）。
D6、D9及OMTS的分子动力学模拟
500 ns的MD模拟表明，D6和D9与PtpB形成的复合物均表现出良好的稳定性，蛋白骨架RMSD分别在1.5-3.0 ?和1.5-3.5 ?范围内波动。两者均与活性位点关键残基（如ASP165, LYS164/166, GLU60/62）形成稳定的氢键和疏水相互作用，接触网络持久。与Apo蛋白模拟相比，配体结合显著稳定了活性位点区域的构象。在整个模拟过程中，D6和D9的结合模式保持稳定。
量子化学描述符分析
DFT计算显示，D6和D9的HOMO能量相近，D6的LUMO能量略高，HOMO-LUMO能隙较小，表明具有一定的化学反应性。D6的平均局部电离能（ALIE）略低于D9，提示其可能存在反应性稍高的位点。两者的自由能均为负值，表明相互作用在生理条件下是自发的。静电势图显示了分子表面的电荷分布，有助于理解与蛋白活性位的潜在相互作用。
先导化合物对PtpB活性的抑制及结合相互作用
在50 μM浓度下，D6和D9在pNPP法检测中表现出最显著的PtpB抑制活性。二维和三维相互作用图显示，它们与活性位点残基（如ASP165, LYS164/166, GLU129等）形成了广泛的氢键和疏水相互作用网络。
剂量反应分析及抑制机制
剂量反应曲线测定D6和D9的IC50值分别为32.62 μM和14.39 μM。Lineweaver-Burk图分析表明两者均为竞争性抑制剂（与底物pNPP竞争结合活性位点），计算得到的抑制常数Ki分别为29 μM和7.2 μM。
BLI测定的结合动力学
BLI分析显示，D6和D9与PtpB均呈浓度依赖性结合。D6的Kd为0.5704 μM，D9的Kd为0.0124 μM，表明D9具有更强的结合亲和力。
细胞毒性评估
MTT实验表明，在HEK293T细胞中，D9在测试浓度范围（1 nM - 100 μM）内未显示明显细胞毒性（存活率>85%）。D6在浓度高达30 μM时细胞存活率>90%，仅在300 μM的高浓度下才观察到显著毒性（存活率<70%）。两者在药理相关浓度下均表现出良好的安全性。
DISCUSSION
PtpB-Mtb是经过验证的结核病药物靶点。本研究成功鉴定出新型吡唑并[4,3-c]吡啶（D6）和1,4-二氮杂?（D9）衍生物作为其抑制剂。
与已报道的强效但可能存在细胞渗透性问题的抑制剂（如草氨酸衍生物，IC50可达nM级）相比，D6和D9的IC50值虽为微摩尔级别，但它们具有更优的类药性质（如适中的分子量、TPSA、脂溶性），为后续优化提供了良好起点。尤其值得注意的是D9在BLI实验中表现出的极强结合力（Kd= 0.012 μM），提示其动力学结合参数优异。这两种新型支架（吡唑并[4,3-c]吡啶和二氮杂?）在药物化学中已知具有生物活性和可修饰性，但此前在抗结核领域尤其是针对PtpB靶点的研究较少，这为发现新机制抑制剂提供了机会。
MD模拟和QM计算从原子层面揭示了化合物与靶点结合的稳定性和电子结构特征。酶学实验和抑制机制分析证实了它们的竞争性抑制特性。BLI提供了直接的生物物理结合证据。细胞毒性评估则为其进一步开发提供了初步的安全性支持。
本研究的局限性在于尚未在细胞感染模型（如巨噬细胞感染模型）中验证其抗结核活性，也缺少对其他人源PTPs的选择性实验数据。这些将是未来研究需要重点关注的方面。
总之，本研究通过整合计算与实验方法，发现了两个具有开发潜力的新型PtpB-Mtb抑制剂先导化合物，为针对该靶点的抗结核药物研发提供了新的起点和方向。
Conclusion
本研究通过基于结构的虚拟筛选、分子模拟和体外实验，成功识别并表征了新型吡唑并[4,3-c]吡啶和1,4-二氮杂?衍生物作为结核分枝杆菌蛋白酪氨酸磷酸酶B的有效抑制剂。这些先导化合物展示了良好的抑制活性、结合亲和力、类药性质及较低的细胞毒性，为克服现有抑制剂在选择性和细胞渗透性方面的挑战提供了有前景的化学支架，推动了抗结核药物发现的研究进程。
ACKNOWLEDGMENTS
（致谢部分，略）
