《Scandinavian Journal of Forest Research》：Rapid germination of seeds of European ash (Fraxinus excelsior) to restore populations in the face of ash dieback
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本综述系统阐述了欧洲白蜡树（Fraxinus excelsior）胚胎快速萌发技术，通过优化Raquin等人（2002）的胚提取方法，显著提升种子萌发效率至100%。该技术突破传统层积处理需时32周的局限（含16周暖温胚胎生长期+16周低温生理休眠解除期），利用NaOH/NaOCl序列消毒与水琼脂软化处理，实现3天内胚转绿、7-10天根系发育。研究证实该方案可支持非专业人员操作，为维持白蜡树遗传多样性（遵循50/500或100/1000规则）、抵御白蜡枯死病（ADB）及白蜡窄吉丁（EAB）双重威胁提供关键技术支撑。
引言
白蜡枯死病（ADB）由真菌病原体Hymenoscyphus fraxineus引起，在欧洲范围内的欧洲白蜡树（Fraxinus excelsior）种群中蔓延，亟需繁殖具有显著抗病性的白蜡树。国际自然保护联盟（IUCN）已将欧洲白蜡树列为近危物种，其种群数量在整个自然范围内持续下降。保护生物学中广泛采用的50/500规则指出，对于像欧洲白蜡树这样具有高繁殖潜力的物种，保留50个个体可避免近交衰退，而维持至少500个个体可防止遗传漂变导致的长期多样性丧失。更谨慎的100/1000规则（100个个体最大限度减少近交衰退，1000个个体减少遗传漂变）则考虑了未来种群碎片化的风险。对于欧洲白蜡树而言，白蜡枯死病可能导致其种群显著下降，但鉴于约5%的树木具有足够强的抗性使其存活至成熟，并且仅在英国就有约108棵成熟欧洲白蜡树，仅凭白蜡枯死病不太可能导致该物种灭绝。然而，白蜡窄吉丁（EAB, Agrilus planipennis）的威胁加剧了繁殖抗性树木的需求。这种蛀干昆虫已对北美的白蜡树种群造成毁灭性打击，目前正在东欧并向西移动。虽然健康的欧洲白蜡树对EAB具有中等抗性，但该甲虫对具有显著白蜡枯死病症状的树木具有高致病性。因此，在遗传多样性的树木种群中抵抗白蜡枯死病是欧洲白蜡树长期生存策略的重要组成部分。由于抗性是多基因性状，从多个个体中进行选择和育种以保留尽可能多的有利等位基因至关重要。此外，白蜡树是许多地区的关键种，在英国就有107种专性或高度关联的物种依赖于白蜡树，如果白蜡树消失，这些物种将面临风险。因此，需要快速生产更健康树木的方法，不仅对于恢复和维持白蜡树种群及其所依赖的生物多样性至关重要，而且对于白蜡树的病理学、昆虫学、生理学和遗传学研究，特别是在害虫和疾病抗性方面，也是可取的。
欧洲白蜡树的受控繁殖与其他白蜡属物种一样面临若干挑战。在商业林业中，白蜡属物种最常通过种子繁殖，但白蜡树种子具有长的休眠期，因此萌发缓慢且不均匀，这对研究和种群的快速恢复都构成了问题。尽管存在这些限制，如果这些问题能够克服，种子繁殖仍然是一个有吸引力的选择，因为雌树产生大量有活力的种子，并且每棵实生苗都是独特的基因型，因此由种子生长的树木具有高的基因型多样性。其他几种繁殖方法已被测试，包括嫁接、扦插和空中压条。嫁接树结合了两种基因型，因此成功生产成年树取决于接穗和砧木都对白蜡枯死病具有抗性，而扦插和空中压条需要高技术技能且劳动密集，成功率通常较低。相比之下，种子允许从健康的成熟（雌性）树木进行繁殖。
白蜡树种子的长休眠期在自然界和当前商业实践中的原因尚未完全明了。Marshall（1981）提出了可能导致这种休眠的几个因素，包括不透氧的果皮导致种皮休眠、胚胎未成熟、胚乳和胚胎中存在代谢抑制剂以及胚胎内缺乏生长促进物质。欧洲白蜡树具有非常坚硬的种皮，包裹着胚胎。它需要长的层积期，既需要温暖阶段以允许胚胎生长，也需要冷阶段以缓解生理休眠，每个阶段至少持续16周。在自然界中，这些种子通常在形成后的第二个春天萌发，但萌发取决于许多环境因素，包括光照可用性、温度、水分和氮素可用性。
从种皮中提取胚胎似乎可以规避休眠问题。Raquin等人（2002）表明，在灭菌和水合种子后提取胚胎，胚胎会继续生长。这打破了休眠，使种子在2-3天内萌发，形成可存活的实生苗，可在3周内移植到堆肥中。该技术比层积处理种子以打破休眠快得多，使得能够为实验目的生产大量白蜡树实生苗。本文描述的方法改编自Raquin等人（2002）的方法，我们对其进行了简化，以实现生产大量欧洲白蜡树植物以及用于实验科学的均匀、整齐萌发实生苗的实用方法。
方法
翅果在英国晚秋和冬季期间变为棕色时从英国多个地点（主要是英格兰东部）收集。立即在室温下通过将其铺在衬有纸的托盘中进行干燥，至少持续2周。这也允许去除任何可能以种子为食或生活在种子上的可见无脊椎动物。
通过从种子中去除果皮组织来准备萌发种子。将准备好的种子放入50 mL裙边塑料离心管中，每管包含来自一棵母树的最多30粒种子（约2 mL体积；取决于需求），但这可以根据可用设备进行调整。为了开始水合过程，将种子在0.3M NaOH中浸泡1小时；加入此溶液和其他溶液以使总体积约为30 mL。然后倒掉溶液，用水冲洗种子，然后加入0.2% v/v NaOCl以水合和灭菌种子，随后将试管在4°C冰箱中过夜。第二天早上，从种子中排掉NaOCl，再次用水冲洗，然后加入更强的2% v/v NaOCl灭菌溶液，在室温下处理2小时。然后再次用水冲洗种子。
从这一阶段开始，所有种子准备步骤均在层流罩中进行以保持清洁。最后一次洗涤后，将种子倒在纸巾上干燥。用非常锋利的手术刀沿一边切割，小心不要切到胚胎。然后将其中10-15粒种子放入含有1%水琼脂（10 g L?1琼脂）的培养皿中，以使种子软化并使胚胎提取更容易。将培养皿置于生长箱中过夜，条件为22°C和16/8小时光/暗循环。第二天，使用锋利的手术刀片（11号）和精细镊子组合，沿着前一天切开的边缘撬开现在已软化的种子，切除胚胎。小心避免损伤胚胎。将胚胎放置在含有2.2 g L?1Murashige & Skoog（MS）培养基（包括维生素，Duchefa品牌）的平板上，额外添加5 g L?1蔗糖和5 g L?1麦芽糖，置于6 g L?1琼脂中（通过高压灭菌制备）。每个平板放置约5-6个胚胎。
将平板化的胚胎放入生长箱中培养约2-3周。3天内，它们开始变绿。7-10天内，根已生长，子叶展开。一旦实生苗长出根，就将它们移栽到添加了砂砾的通用堆肥中的小盆里。实生苗在移回生长箱之前保持在喷水的钟罩下，因为它们已经适应了培养皿中的高湿度。5天后通过撑起盖子逐渐揭开钟罩以鼓励更多空气流通，然后完全移除。在生长箱中至少3周后，植物可以移出并转移到温室或塑料大棚中继续生长。
本文描述的方法与Raquin等人（2002）的方法主要区别如下：我们在过夜灭菌步骤中使用NaOCl代替Ca(OCl)2，因为前者更容易获得。Raquin等人（2002）使用“H0”培养基（不含额外糖的MS培养基）进行过夜培养。我们用2%水琼脂代替H0培养基；这似乎对种子活力没有不利影响。我们简化了第二种培养基“H10”（添加糖的MS培养基），使用市售的含维生素的MS培养基，每升用量减半，而不是像Raquin等人（2002）那样使用单独的宏量和微量营养素配制；同样，这似乎对实生苗生长没有不利影响。我们还使用0.6%的琼脂，而不是Phytagel（0.2%）和琼脂（0.4%）的混合物。我们在生长箱中使用22°C而不是26°C，以更符合英国的温度并降低运行生长箱的成本，同时仍足够温暖以快速发育。这个温度可能需要根据种子来源地的纬度进行调整。最后，我们将几粒萌发的种子放在一个琼脂平板上，而不是将一粒种子放在单独的培养管中，这使得过程更简单、更便宜。
结果
在去除受损或污染的胚胎后，每批约30粒种子的萌发率高达100%。Raquin等人（2002）报告了取决于处理的萌发率变化（未切割种子（0%）、部分切割种子（14%）和整个种子切割（88%））。他们没有手动从种子中切除胚胎。在这里，我们部分切割种子，但在2%水琼脂上放置24小时后手动提取胚胎。仔细提取胚胎可能使得本文报告的高成功率成为可能。我们工作的目标是使萌发方法尽可能简单、高效和廉价，以实现大规模使用，包括非专业人员的使用，我们并未尝试与Raquin等人（2002）的方法进行逐点比较。
该方法与Raquin等人（2002）的方法的一个显著区别是种子没有失去棕色涂层或看起来透明且胚胎可见。这可能是因为我们使用了NaOCl而不是Ca(OCl)2，尽管使用Ca(OCl)2可能允许在更早阶段选择胚胎。如果单个种子价值高，这可能很重要，但由于我们可以收集和处理数千粒种子，这对我们的目的并不关键。我们还使用水琼脂而不是营养琼脂让种子过夜软化。这似乎对萌发没有不利影响，因为胚胎能够被提取并发育成实生苗。使用水琼脂而不是营养培养基更简单、更便宜。
成功萌发率取决于几个因素，最重要的是种子质量。许多胚胎在种皮内被昆虫或其他食草动物吃掉或损坏，但损伤在灭菌阶段通常不可见，只有在种子切开后才变得明显。Raquin等人（2002）也报告说真菌或昆虫破坏了它们某些种子批次的60%以上。受损的胚胎呈棕色，不是坚实的苍白组织，而是有较软的棕色斑块。当平板培养时，这些胚胎通常不会变绿，并且经常有细菌污染。在食草动物损害水平高的劣质种子批次中，总萌发率可能低至零。
必须小心避免在从种子中提取时损伤胚胎。白蜡树种子的大小和形状各异，通常很难分辨哪一端是胚珠孔（胚根附着处），有时会意外切除。随着技术经验的积累，无损伤提取得到改善。如果在提取过程中胚根受损，即使胚胎变绿，根也可能完全不发育。在种子干净且质量好的情况下，物理损伤是萌发失败的最常见原因。
如果实生苗在移栽到堆肥前在平板上放置时间过长，培养皿内空间不足可能导致茎部弯曲变形。移栽后这不会变直，因此植物保持畸形。这可能对植树产生长期后果，因此应避免。遵循Raquin等人（2002）的方法，在子叶和根刚开始生长时将生长的实生苗放入组织培养管或类似容器中，会降低茎部弯曲的风险，但会增加所需的劳动力和技能。
尽管存在这些问题，几乎可以从所有种子批次中萌发足够多的种子以达到目标实生苗数量。例如，在一批中，我们从24个家系（来自不同母树）各准备了10粒种子，目的是每个家系获得5株植物。每个家系平均71%的胚胎萌发（范围：每个家系3-10粒），每个家系平均有0.5个胚胎被细菌污染（范围：0-6个胚胎）。在第二批45个家系中，每个家系准备了30粒种子，平均56.1%的种子萌发（范围：每个家系4-24粒）。在某些种子批次的萌发中，我们发现种子批的污染可能非常严重，以至于没有胚胎能够萌发。然而，通过仔细选择种子和重复萌发，始终可以从每个家系生产出一些实生苗。
实生苗在生长箱中生长迅速，但将盆栽实生苗移至温室的时机至关重要。在年初萌发并于3月移至温室的实生苗没有进一步生长，并且大部分失去了所有叶子。其中许多但在生长后期恢复了。从4月到6月移至塑料大棚的植物在10月或11月初经历衰老，这在当地环境中是自然的。然而，在3月转移的植物在季节早期生长不良，然后在10月仍在长出新叶；如果植物没有足够长的休眠期，这可能会对下一个季节产生影响。
截至撰写本文时（2026年1月），我们已经从116个家系生产了超过2000株实生苗，用于实验和田间试验。该过程历时3天，大部分工作用于提取胚胎。为了评估增加生产的潜力，一个人能够在4小时内提取300个胚胎。
讨论
我们工作的目标是开发一种萌发欧洲白蜡树种子的方法，该方法可可靠地用于生产大量植物。因此，现在可以从足够多的母树（至少50棵）生产足够的树苗（至少500棵），以达到50/500指南的要求，甚至可以达到更谨慎的100/1000指南，以实现诸如一个英国郡（中位数2700 km2）内欧洲白蜡树种群的长期恢复。为了增加种群中的抗性水平，应选择具有显著高于平均抗性的更健康母树。这应增加育种库中的抗性基因数量，从而降低后代的平均易感性。现在的主要挑战是识别这些树木，但这可以由经过培训能够识别白蜡枯死病症状的观察者完成，不需要专业的科学技能。
我们旨在进一步简化本文报告的方法，使非专业人员能够为自己的目的生产树木，例如社区苗圃恢复当地白蜡树种群。这将需要使用容易获得的化学品，如家用漂白剂，并避免对环境控制箱的需求。
该方法特别适合于生产需要同龄树木的实验用植物。特别是，它意味着研究白蜡枯死病抗性和耐受性遗传学的实验（这些受复杂遗传控制，例如Stocks等人（2019）报告了超过3000个与降低易感性相关的位点，每个位点效应很小）不再受长而不均匀的种子休眠期阻碍。
出于研究目的，我们尝试萌发了来自白蜡、宽叶白蜡、绒毛白蜡、花白蜡和单叶白蜡的种子。我们没有测试狭叶白蜡，Raquin等人（2002）发现其萌发率高于欧洲白蜡。单叶白蜡的种子胚胎非常小，我们不容易提取；我们目前正在研究在提取前提高胚胎成熟度。花白蜡的种子种皮特别坚硬，难以提取，表明在提取前可能需要进一步的化学处理来软化种皮。其他白蜡属物种的胚胎提取使用与本文描述的欧洲白蜡相同的方法进行，发育时间非常相似。
对于某些目的，可能希望克隆特定树木，例如繁殖观赏性白蜡属基因型或具有特别理想表型（如对白蜡枯死病具有极高抗性）的雄性欧洲白蜡树。然而，对于生产数百或数千棵树，我们发现使用实生苗在时间、技能和资源方面比扦插、嫁接或空中压条效率高得多。在两年期间，我们仅从97棵祖先树中的5棵获得了生根插条，并且成功率很低；我们仅从两棵树获得了超过两根生根插条。嫁接通常成功，但依赖于砧木的可用性，而砧木本身可能对病原体不具有抗性。此外，老年白蜡树嫁接失败率未知。空中压条通常用于热带作物，如芒果，但我们在该方法上取得了一些成功。它产生具有自身根系的植物，因此规避了砧木基因型未知的问题，并且我们成功在嫁接树上进行了空中压条。因此，空中压条适用于生产少量特别有价值的欧洲白蜡树。我们不推荐任何这些方法用于生产大量种植材料，因为它们产生克隆树，从而限制了基因型多样性，而通过从种子高效繁殖欧洲白蜡树可以轻松增强基因型多样性。
