基质辅助室温干燥技术实现功能性蛋白质的热稳定化研究

《Engineering》：Thermostabilizing Functional Proteins with Matrix-Assisted Room-Temperature Drying

本研究针对蛋白质长期保存依赖冷链运输、冻干工艺能耗高且易引发冷冻损伤等问题，开发了一种基质辅助室温（MART）干燥技术。研究人员将乳酸脱氢酶（LDH）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）及逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）试剂与保护剂共混后，在生物相容性纤维素纤维基质上进行室温或低温真空干燥。结果表明，MART干燥能有效保持蛋白质结构和功能，显著提升其热稳定性，为生物制剂在资源有限地区的储存和运输提供了低能耗、低成本的新策略。

　　

在生物医药和诊断领域，功能性蛋白质的长期保存一直是个棘手难题。蛋白质本身结构脆弱，离开原生环境后容易降解失效。传统的解决方案是冷冻保存或冻干处理，但这两种方法都存在明显局限：冷冻过程会产生冰晶界面压力、溶质浓度变化等应激反应，损伤蛋白质结构；而冻干技术虽然能制备固体制剂，却需要经历冷冻和真空干燥双重应激，且设备昂贵、能耗高、耗时长。更关键的是，无论是冷冻还是冻干保存，后续的储存和运输都离不开"冷链"系统——一个需要全程温控的高成本物流体系。在电力匮乏地区，冷链难以覆盖，即便在发达国家，运输过程中的温度波动也常导致蛋白质制剂失效报废。

面对这些挑战，牛津大学研究团队在《Engineering》上发表了一项创新研究，提出了一种名为"基质辅助室温干燥"（matrix-assisted room-temperature drying, MART）的蛋白质稳定化技术。该技术完全避免了冷冻步骤，直接在室温或轻度加热条件下（约30°C）完成干燥，大幅降低了能耗和设备要求。

研究团队采用了两种具体的干燥方法：MART-DA干燥（循环干空气干燥）和MART-V干燥（真空辅助干燥）。前者通过循环干燥空气在18小时内完成水分去除；后者利用真空环境加速质量传递，仅需3小时即可达到相同干燥效果。关键技术环节包括：将蛋白质与保护剂（海藻糖、右旋糖酐等）混合后负载于三维多孔纤维素纤维基质上，利用基质纤维间形成的毛细管桥效应，在干燥过程中通过马兰戈尼流（Marangoni flow）使蛋白质向保护剂浓度高的区域富集，最终被封装于形成的糖玻璃膜中。

在蛋白质功能评估方面，研究选取了三种代表性模型：对冷冻敏感的标志酶乳酸脱氢酶（LDH）、具有重要医学应用价值的成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）以及用于COVID-19检测的RT-LAMP试剂盒中的多种酶体系。通过扫描电子显微镜（SEM）观察干燥后基质形态，采用酶活性测定、细胞增殖实验（CCK-8法）和横向流动检测（LFT）等功能性分析方法评估蛋白质稳定性。

3.1. MART干燥LDH

研究人员发现，保护剂配方对干燥效果至关重要。当海藻糖浓度达到500 mmol·L^-1时，LDH活性保留率达88%；添加10%右旋糖酐后进一步提升至92.83%。差示扫描量热法（DSC）显示，该配方的玻璃化转变温度（T_g）从单一海藻糖的54.81°C升至60.04°C，表明热稳定性增强。值得注意的是，纤维素纤维基质本身对蛋白质存在吸附作用，约7.7 μg LDH会非特异性结合到20 mg基质上。通过牛血清白蛋白（BSA）预涂层处理，可有效减少这种吸附损失。SEM图像清晰显示，干燥后在纤维间形成了光滑的糖玻璃膜，证实了毛细管桥机制的成功运行。

长期稳定性测试表明，经MART干燥的LDH在25°C储存6个月后，活性保持水平与-20°C及-80°C冷冻保存组无显著差异。即使在40°C高温下储存一周，优化配方（1 mol·L^-1海藻糖+10%右旋糖酐）仍能保持90%以上的活性，其T_g升高至70°C以上，有效抑制了储存期间的应力松弛现象。

3.2. MART干燥FGF-2

在FGF-2的研究中，干燥后的蛋白质在40°C储存一周后重建，用于培养人间充质干细胞（MSC-hTERT）。细胞增殖实验显示，与新鲜FGF-2相比，MART-DA和MART-V干燥的FGF-2均能显著促进细胞增殖（超过四倍增加），效果无统计学差异。同时，生物相容性试验证实纤维素纤维基质对细胞无毒性，细胞形态和生长状态正常。这表明MART干燥的FGF-2在伤口愈合和化妆品等领域具有直接应用潜力。

3.3. MART干燥RT-LAMP试剂

针对RT-LAMP检测试剂，研究团队将包括逆转录酶、Bst 2.0聚合酶、引物等在内的全套试剂通过MART-V干燥固定在5 mg纤维素基质上。干燥后的试剂在40°C储存一周后仍能有效检测SARS-CoV-2 RNA模板（CT值33.7），横向流动试纸条检测结果与凝胶电泳一致。这一成果为在资源有限地区实现常温运输和储存的分子诊断试剂盒开发奠定了基础。

3.4. 讨论

研究团队指出，MART干燥技术的成功关键在于毛细管桥的形成和保护剂配方的优化。虽然部分蛋白质会因基质吸附而损失，但BSA涂层可有效缓解这一问题。该技术的主要优势在于操作简单、能耗低、设备要求不高，且易于放大生产。蛋白质可在任何容器或开放托盘中干燥，适用于工业级干燥设备。局限性在于目前尚未对干燥过程中的传热传质速率进行量化研究，这在放大应用中需要重点关注。

研究表明，MART干燥技术能有效保持多种功能性蛋白质的活性和结构完整性。特别是对于传统冷冻保存易受损的蛋白质（如LDH），该技术避免了冷冻应激，显示出独特优势。纤维素纤维基质的生物相容性和可塑性，为开发可直接应用的生物制剂型（如伤口敷料）提供了可能。更重要的是，这项技术打破了蛋白质保存对冷链的依赖，为在资源有限地区推广生物制剂和诊断试剂创造了条件，对全球公共卫生事业具有重要价值。