《Frontiers in Fungal Biology》：Native oleaginous yeasts Rhodotorula mucilaginosa and Solicoccozyma gelidoterrea: a sustainable biotechnological alternative for lipid production with potential application in diets for farmed fish
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本综述深入探讨了两种从智利火山土壤中分离的本土产油酵母——Rhodotorula mucilaginosa (Rho 6S) 和 Solicoccozyma gelidoterrea (7C)，在作为水产养殖饲料可持续脂质来源方面的巨大潜力。研究通过系统评估不同碳源、碳氮比（C/N）和温度（7–25 °C）对生长动力学、底物利用及脂质积累的影响，揭示了二者独特的生理响应和脂质重塑策略。R. mucilaginosa 在25 °C和C/N 20条件下展现出卓越的代谢多样性和脂质产量（脂质含量30%），其脂质谱富含单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA），营养指数（如MUFA/SAFA、PUFA/SAFA）优异。而 S. gelidoterrea 则表现出显著的低温适应性（7 °C时脂质含量达26.6%），并能在胁迫条件下合成长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）。该研究为利用微生物平台开发功能性水产饲料脂质提供了新的见解和可行性路径。
引言
水产养殖业的快速全球扩张加剧了对鱼饲料配方中可持续和替代性脂质来源的需求，驱动了对具有特殊代谢能力的微生物平台的兴趣。其中，产油酵母因其积累大量细胞内脂质储备以及根据环境和营养信号调节脂肪酸组成的能力而成为有前景的候选者。
方法
本研究调查了从智利南部火山土壤中分离的两种本土酵母菌株的脂质生产潜力和生理响应。通过ITS测序将菌株鉴定为Solicoccozyma gelidoterrea (7C) 和 Rhodotorula mucilaginosa (Rho 6S)。系统评估了不同碳源、碳氮比（C/N）和温度范围（7–25 °C）下的生长动力学、底物利用和脂质积累。应用响应面方法确定营养和热因素对生物量生产和脂质产量的联合效应，同时分析脂肪酸组成以阐明脂质重塑策略。
结果与讨论
R. mucilaginosa 表现出显著的代谢多样性，其特征是在木糖、蔗糖和水苏糖等替代碳源上具有更高的最大比生长速率。在最佳条件（25 °C，C/N 20）下，该菌株实现了30%的脂质含量和2.54 g/L的生物量浓度。相比之下，S. gelidoterrea 表现出与冷适应相关的独特生理特征，在7 °C和C/N 20时达到最佳脂质积累，脂质含量为26.6%，生物量为2.11 g/L。将C/N比提高到90显著限制了两个菌株的脂质积累，突出了氮可用性在调节酵母脂质代谢中的核心作用。脂肪酸谱分析揭示了明显的物种特异性脂质重塑模式：R. mucilaginosa 产生了营养上有利的脂质谱，富含单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，反映在高MUFA/SAFA和PUFA/SAFA比率上。相比之下，S. gelidoterrea 在氮限制和低温条件下表现出以单不饱和脂肪酸（尤其是油酸）为主的独特脂质谱，并在胁迫条件下证明了合成长链多不饱和脂肪酸的能力，表明其激活了适应性和胁迫响应的脂质代谢途径。
结论
本研究首次提供了S. gelidoterrea脂质积累和脂肪酸组成的证据，并揭示了本土产油酵母之间对比鲜明的脂质代谢策略。这些发现共同促进了对真菌脂质生理学和环境适应的更深入理解，并支持了本土酵母菌株作为功能性食品和水产养殖营养的可持续脂质来源的潜力。
1 引言
水产养殖，主要是鱼类和虾类的持续增长，作为全球粮食安全的战略部门，导致对平衡饲料配方中使用的原料需求增加，特别是那些富含高质量脂质和蛋白质的原料。目前，鱼油和鱼粉是许多水产饲料系统的关键组成部分，因为它们具有必需营养素的高生物利用度，例如长链多不饱和脂肪酸（PUFAs），尤其是EPA和DHA。然而，渔业资源的密集开发引发了环境、经济和伦理问题，凸显了识别替代和可持续脂质来源的迫切需求。在这种背景下，产油酵母已成为最有前途的替代品之一。几位作者报道了酵母中的脂质积累，最有前途的脂质生产物种包括Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Cutaneotrichosporon curvatum, Candida diddensiae, Metschnikowia reukaufii, Candida tropicalis, Solicoccozyma terricola, Naganishia albida, Papiliotrema laurentii, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Rhodotorula mucilaginosa, Apiotrichum domesticum, Trichosporon asahii, Tausonia pullulans, Yarrowia lipolytica, 和 Schwanniomyces etchellsii etchellsii。这些酵母中的大多数主要在细胞质膜中积累脂质，约占细胞干重的25%，以甘油三酯（TGs）的形式存在，最大TG生产通常发生在营养限制条件下，如氮或磷缺乏，结合过量碳源。在感兴趣的物种中，Rhodotorula mucilaginosa 和 Solicoccozyma spp. 因其生产微生物油的能力而脱颖而出，其脂质谱可与植物油相媲美，并且在某些情况下富含对动物健康有益的多不饱和脂肪酸。这些酵母可以在由农业工业残留物、富含有机物的废水或食品工业副产品组成的培养基上培养，这不仅降低了生产成本，而且在可持续性和循环经济方面提供了附加价值。产油酵母中的脂质积累受一系列生理、营养和环境因素的控制。最关键的因素之一是碳氮比（C/N），当升高时，通过在氮限制条件下将细胞代谢重新导向脂肪生成来促进脂质积累。此外，碳源的类型和微量营养素（如磷、硫和镁）的可用性直接影响脂肪生成能力。特别值得注意的是磷酸盐限制的影响，它已被证明能增强如Yarrowia lipolytica等物种的脂质积累，尽管通常以降低总生物量为代价。培养的物理化学条件，如pH和温度，也调节脂质生物合成。pH值在5.0至6.5之间通常是产油酵母中甘油三酯积累的最佳选择。温度反过来影响生长和脂肪酸组成：较低温度倾向于支持更高的不饱和度，而较高温度增强生物量生产但可能降低脂质含量。其他关键因素包括氧气可用性，它调节参与脂肪生成的关键酶的活性，以及碳源浓度，必须维持在适当水平以避免抑制效应。理解和控制这些参数对于优化工业目的的脂质生产至关重要，例如营养保健品制造。从营养角度来看，从酵母中提取的脂质作为功能性成分具有相当大的潜力，可以纳入鱼类和甲壳类动物的饮食中。然而，产油酵母在水产养殖中的应用不仅限于其脂质部分，因为它们可以被视为其他重要化合物的来源。某些菌株，如Rhodotorula spp.，除了其产油潜力外，还证明了合成类胡萝卜素如β-胡萝卜素和圆红酵母素的能力，这些抗氧化化合物可以增强水生动物的免疫系统并提高其对病原体的抵抗力。此外，这种富含蛋白质、多糖和生物活性化合物的生物量也可以用作蛋白质或益生元来源，促进肠道健康并支持养殖动物更平衡的肠道微生物群。这种综合方法允许最大化资源利用并开发多功能产品，从而支持更可持续和高效的生产模式。研究表明，如Lipomyces starkeyi和Rhodotorula toruloides等酵母可以有效地替代鱼类饮食中的植物油，而不会损害如北极红点鲑等物种的生长性能或健康。在Sanahuja等人（2023）的研究中，通过分析与体细胞生长和饲料效率相关的关键绩效指标（KPIs），评估了补充Debaryomyces hansenii的饮食对金头鲷的影响。此外，该研究调查了转录组谱、前中肠的组织学结构和本地微生物群组成，以更好地了解包括D. hansenii的饮食如何影响鱼类生理。在饲喂低鱼粉饮食的金头鲷幼鱼中，膳食补充酵母显著改善了体细胞生长和饲料效率（增加了12%），且对肠道健康没有不利影响。转录组分析揭示了关键代谢途径的调节，包括蛋白质、脂质和核苷酸代谢，以及增强的抗氧化和免疫反应。类似地，在Brunel等人（2022）的研究中，评估了部分包含产油酵母Rhodotorula toruloides生物量作为替代植物油在北极红点鲷饮食中的效果。结果表明，实验组肝脏重量和肝体指数显著增加，但肝脏和肌肉脂质含量或肝脏组织学改变没有显著差异。尽管肌肉中的脂肪酸谱在各组间具有可比性，但在饲喂酵母生物量的鱼的肝脏中观察到更高比例的单不饱和脂肪酸。在另一项研究中，Singh等人（2024）评估了完整和自溶的Yarrowia lipolytica对幼年虹鳟鱼的影响，报告称膳食包含5%完整酵母增强了肠道免疫基因表达，尽管在生长或整体微生物群组成方面未观察到显著变化。毫无疑问，这些微生物油的营养特性和脂质谱对动物健康的各个方面都有直接影响，这些由关键脂质营养指标决定，如MUFA/SAFA、PUFA/SFA和LA/ALA比率等，并且最终可以以低包含水平纳入鱼类饮食，前提是生产技术允许以合理的成本实现。
我们的研究旨在增强和评估本土酵母R. mucilaginosa Rho 6S和Solicoccozyma gelidoterrea 7C中的脂质积累，并分析它们在不同培养条件下的脂质谱。
2 方法
2.1 微生物
两种本土产油酵母菌株R. mucilaginosa Rho 6S和S. gelidoterrea 7C分别从阿劳卡尼亚地区土壤（坐标38°42′08.1′′S 72°32′49.7W，UCT北校区）和比利亚里卡火山斜坡Cerduo Sector（坐标39°21′32.9′′S 71°53′38.W¨W）分离。这些菌株经过分子鉴定，并在GENBANK数据库中注册（Rho 6S：PP209387.1，7C：PV784691）。本土酵母R. mucilaginosa Rho 6S已被初步表征和分子鉴定。
2.2 接种物制备和菌株保存
酵母保存在4°C的沙氏琼脂固体培养基上，并每4周复制一次以创建新鲜培养物。酵母培养物在液氮冷冻后保存在-80°C的冷冻保存器中。接种物在含有2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物，最终体积为100 mL的液体培养基中制备。培养基接种以1 × 106细胞/mL浓度、指数生长期的24小时新鲜酵母培养物。将培养物置于往复式摇床中，温度25°C，转速150 rpm，直至达到指数期。
2.3 PCR扩增和酵母DNA测序
菌株7C的一般表征如下：使用引物ITS1 (5′ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’) 和ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) 扩增核核糖体DNA（rDNA）26S基因的部分片段。PCR反应在25 μL体积中进行，包含GoTaqR Green Master Mix（Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2）和0.5 μL的正向和反向引物。ITS1-ITS4片段的扩增在以下条件下进行：初始变性（95°C 2分钟），30个循环的变性（94°C 1分钟）、退火（52°C 40秒）和延伸（72°C 1分钟），然后是最终延伸（72°C 10分钟）。4 μL PCR产物在1.5% TAE 1X琼脂糖凝胶上分析，并使用FOTO/UV21透射仪观察。使用100 bp DNA分子量标记。DNA浓度在Nanodrop, Infinite M200上测量。扩增的DNA经过纯化并送往智利瓦尔迪维亚的Austral-Omics进行测序。
2.4 酵母菌株分子鉴定
使用SeqTrace软件从菌株7C的互补序列获得一致的ITS序列。进行BLAST搜索以将所研究菌株的序列与GenBank中当前代表的真菌物种序列进行比较。检索了代表Solicoccozyma所有当前公认物种的模式菌株和其他参考菌株的ITS序列用于系统发育研究。使用MUSCLE网络服务器进行DNA序列比对，然后使用文本编辑器手动调整。使用MEGA X进行最大似然法（ML）和邻接法（NJ）的系统发育分析，使用该软件选择的最佳DNA替代模型。通过1000次重复的bootstrap分析评估分组的统计支持。ITS数据集和系统发育树 deposited in Figshare with the DOI 10.6084/m9.figshare.29321501。
2.5 不同碳源和胁迫化合物对细胞生长的影响
从在24种不同条件下培养的酵母菌株的生长曲线获得生长动力学参数。所有化合物购自Merck，并制备为标准工作浓度，常用于酵母表型分析：咖啡因（0.5 mM）、CuSO4（0.2 mM）、DTT（2 mM）、乙醇8%、9%和10%（v/v）、果糖（2% w/v）、G418（200 μg/mL）、半乳糖（2% w/v）、甘油（2% v/v）、过氧化氢（H2O2，2 mM）、KCl（0.5 M）、乳糖（2% w/v）、麦芽糊精（2% w/v）、麦芽糖（2% w/v）、甲醇（8% v/v）、NaCl（1 M）、对香豆酸（0.5 mM）、水苏糖（2% w/v）、蔗糖（2% w/v）、SDS（0.01% w/v）、山梨醇（1 M）和木糖（2% w/v）。初始预培养通过将酵母菌株接种到含有200 μL 2% YNB-葡萄糖培养基的96孔微孔板中建立，随后在20°C（菌株7C）和25°C（菌株Rho 6S）下培养24小时。使用的参考菌株是Saccharomyces cerevisiae BY4741。预生长后，将每种培养物的5 μL转移到195 μL相应的测试培养基中。使用配备BioStack 4的Cytation 3系统培养培养物，每小时间隔记录600 nm处的光密度（OD600）。使用R中的“gcplyr”包计算生长参数，并使用基于base stats包中prcomp函数的自定义R脚本进行主成分分析（PCA）。此外，基于酵母菌株R. mucilaginosa (Rho 6S) 和 S. gelidoterrea (7C) 在不同碳源和胁迫诱导化合物下的最大比生长速率（μmax）生成热图。颜色尺度代表μmax值，其中深红色表示高生长，蓝色表示无或负生长，淡红色调反映中间水平。应用层次聚类以突出实验条件间生长模式的相似性。
2.6 温度和碳氮比对本土酵母脂肪酸积累的影响
在分批培养中评估本土酵母菌株（Rho 6S和7C）在不同培养温度（Abaza等人，2021）和不同碳氮比（C/N）下的表现。基础培养基（BCM）含有66.6 g/L葡萄糖、0.4 g/L MgSO4·7H2O、2 g/L KH2PO4、0.003 g/L MnSO4·H2O、0.0001 g/L CuSO4·5H2O、1.5 g/L酵母提取物和不同浓度的(NH4)2SO4（基于C/N比）。计算C/N比时，考虑葡萄糖每克贡献0.4克碳，硫酸铵每克贡献0.2121克氮。培养在1000 mL锥形瓶中进行，工作体积600 mL，在200 rpm和pH 5.5下培养，温度适合各菌株（Rho 6S为25°C；7C为20°C）。培养在往复式摇床中进行。接种量为10% v/v（指数期108细胞/mL）。锥形瓶通过高压灭菌在121°C，1 atm下灭菌15分钟。实验根据响应面方法（RSM）的中心复合设计（CCD）进行设计和实施，考虑两个因素：C/N比（20–90）和温度变化（7、16°C或各菌株的最适温度），使用Design-Expert?软件，版本12。培养物最初在其最适温度下生长（Rho 6S为25°C，7C为20°C）。达到指数期末（Rho 6S为48小时，7C为72小时）后，根据实验条件将温度降低至7°C或16°C，或维持在最佳水平。测量以下响应变量：生物量（克干重/升）、总脂质的比生产率（毫克/克干生物量）、总脂质含量、脂质谱（MUFA：单不饱和脂肪酸，PUFA：多不饱和脂肪酸，SAFA：饱和脂肪酸，AL：亚油酸（C18:2 ω6），ALA：α-亚麻酸（C18:3 ω3）），营养脂质指数：（LA/ALA（亚油酸/α-亚麻酸）；MUFA/SAFA（单不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸），PUFA/SAFA（多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸）。
2.7 分析方法
2.7.1 细胞生物量（酵母）定量
培养后酵母细胞生物量产量将在离心（3000× g，10分钟，4°C）后在预先称重的套管中测定。离心后的细胞生物量将在80°C（WTC Binder烘箱）下干燥24小时至恒重。生物量产量将表示为每升培养基中酵母干重的克数（克干重/升培养基）。
2.7.2 脂肪酸组成
使用气相色谱（GC）分析酵母生物量样品的脂肪酸（FA）组成。在脂质提取之前，通过用酸洗玻璃珠（直径0.5 mm）剧烈振荡破坏样品以确保完全细胞裂解，并通过在105°C下将等分试样干燥至恒重来测定水分含量，从而允许数据基于干重进行标准化。然后使用T10 Basic Ultra-Turrax分散器进行均质化。脂质按照Breil等人（2017）的方法使用氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）提取，并添加十七烷酸（C17:0）作为内标以监测回收率并实现定量。然后使用14%三氟化硼（BF3）的己烷溶液将提取的脂质甲基化为脂肪酸甲酯（FAMEs）。使用配备火焰离子化检测器（FID）和氦气作为载气的气相色谱仪分析FAMEs。使用Supelco SP2380毛细管柱实现分离，进样器和检测器温度分别设定为220°C和200°C。柱温箱程序如下：初始温度60°C保持1分钟，以4°C/分钟升至204°C，随后以2°C/分钟升至240°C，并在此最终温度保持2分钟。通过与37组分FAME标准混合物比较来鉴定脂肪酸，并使用HP ChemStation软件基于外部标准制备的校准曲线进行定量。通过保持重复进样间的变异系数（CV）低于5%来验证分析精度。结果表示为相对于总鉴定脂肪酸的峰面积百分比。
2.7.3 葡萄糖含量
通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法在540 nm处测量葡萄糖浓度，其中碱性溶液中的3,5-DNS被还原糖还原为3-氨基-5-硝基水杨酸。制备葡萄糖标准曲线并用于估计未知还原糖浓度。
2.8 统计分析
检验了在不同温度冲击和C/N比条件下生物量生产、总脂质含量、脂肪酸部分（SAFA、MUFA、PUFA）和特定脂肪酸（LA、ALA）的差异。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，同时使用Levene检验评估方差齐性。由于一些变量不符合正态性和方差齐性的假设，应用非参数Kruskal–Wallis检验来检测总体差异。随后，使用Games–Howell多重比较检验来评估组内差异，即在每个温度条件下评估的不同C/N比之间的差异。这种方法能够精确识别显著影响每个特定温度制度的营养条件。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics软件，版本31.0.0.0进行。对所有响应变量（生物量、总脂质和脂肪酸部分：SAFA、MUFA、PUFA、ARA、LA和ALA）在每个温度（25、16和7°C）和C:N比（20、55和90）下获得描述性统计。为了评估每个温度内C:N比的影响，应用了基于20%修剪均值的稳健单向ANOVA，并使用bootstrap重采样（599次迭代）来估计p值和置信区间。计算效应大小以量化处理间差异的幅度。分析在Jamovi软件（版本2.6.45.0）中进行，显著性水平为p < 0.05。结果在补充材料的补充表TS4–TS7中呈现。
3 结果
3.1 分子鉴定
菌株7C的ITS序列的BLAST搜索显示，最接近的匹配是S. gelidoterrea的菌株，例如CBS 15580（模式菌株，GenBank MK050340，一致性559/560，99.82%，1个间隙），CBS 9627（GenBank KY105431，一致性559/560，99.82%，1个间隙）和C
