《Advanced Science》：A LDH-Based Supramolecular Photosensitizer-Functionalized Bioactive Glass Scaffold for Integrated Postoperative Osteosarcoma Recurrence Prevention and Bone Regeneration
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本研究报道了一种创新的双功能复合支架（BGS/I-LDH），通过将5-碘代间苯二甲酸（I-IPA）插层的MgZnAl层状双氢氧化物（LDH）负载于生物活性玻璃支架（BGS）构建而成。该支架在1270 nm近红外激光照射下表现出极高的活性氧生成能力和单线态氧量子产率（达1.53），可高效抑制骨肉瘤。同时，其持续释放的Mg2+和Zn2+离子赋予其卓越的成骨性能，在动物模型中实现了骨体积、骨矿物质密度和新骨质量数倍的显著提升，为术后骨肉瘤的综合管理与骨缺损重建提供了一种极具前景的新型治疗平台。
引言
骨肉瘤是一种好发于青少年的侵袭性恶性骨肿瘤，临床治疗主要依赖手术切除和围手术期辅助化疗，但常面临肿瘤复发、转移及术后骨缺损修复不佳的挑战。理想的治疗方案需同时实现残余肿瘤细胞的彻底清除和有效的骨结构重建。生物活性玻璃支架（BGS）因其良好的生物相容性、力学性能和成骨特性，在骨组织工程中应用广泛。层状双氢氧化物（LDH）作为一种层状纳米材料，在肿瘤治疗、药物递送和组织工程中展现出巨大潜力。光动力疗法（PDT）因其非侵入性、高时空精度和副作用小等优点备受关注。本研究旨在开发一种兼具高效抗肿瘤和显著成骨性能的双功能复合支架，用于术后骨肉瘤复发预防与骨再生。
结果与讨论
I-LDH的制备与表征
通过共沉淀法将5-碘代间苯二甲酸（I-IPA）插层到MgZnAl-LDH主体中，成功制备了I-LDH。透射电镜（TEM）图像显示I-LDH呈均匀的纳米片状形态，平均直径约为450 nm。原子力显微镜（AFM）和X射线衍射（XRD）等表征证实了I-IPA的成功插层。紫外-可见-近红外吸收光谱显示I-LDH在近红外二区（NIR-II）有强吸收，为其用于NIR-II PDT提供了前提。
BGS/I-LDH支架的合成与表征
通过表面涂覆法将I-LDH纳米片整合到BGS上，构建了BGS/I-LDH复合支架。扫描电镜（SEM）显示，与原始BGS相比，BGS/I-LDH表面更为粗糙，有利于细胞粘附。元素Mapping图像证实了I-LDH相关元素在支架上的均匀分布。力学性能测试表明，I-LDH功能化提升了支架的抗压能力。体外和体内降解性评估显示，BGS/I-LDH的降解率略高于BGS，可能与I-LDH涂层的降解有关。
I-LDH的单线态氧生成检测
I-LDH在1270 nm激光照射下表现出卓越的单线态氧（1O2）生成能力。使用单线态氧传感器绿（SOSG）和1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）等探针进行检测，证实I-LDH可产生大量1O2。其1O2量子产率高达1.53，显著优于先前报道的大多数近红外激发光敏剂。电子自旋共振（ESR）谱也观察到了典型的1O2三重态信号。
BGS/I-LDH支架的单线态氧生成与离子释放
得益于I-LDH的高效光动力活性，BGS/I-LDH支架在1270 nm激光照射下也显示出优异的1O2生成能力。SOSG荧光强度随浸渍浓度增加而增强。离子释放动力学研究表明，在模拟生理环境下，BGS/I-LDH能够持续释放Mg2+和Zn2+离子，且释放速率在酸性微环境中（如肿瘤部位）更快，有利于在骨肿瘤切除部位促进成骨，同时持续的离子释放确保了长期的骨重塑。
体外生物相容性、抗骨肉瘤效应及成骨特性评估
细胞毒性实验表明，BGS和BGS/I-LDH对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1均表现出良好的生物相容性。在1270 nm激光照射下，BGS/I-LDH能高效杀死人骨肉瘤Saos-2细胞，细胞存活率降至9.8%，而清除剂实验证实1O2是诱导细胞死亡的主要活性氧物种。钙黄绿素-AM/碘化丙啶双染、流式细胞术细胞凋亡分析等均验证了其高效的光动力杀伤效果。对于人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），BGS/I-LDH在培养后期促进了细胞增殖，其粗糙的表面更有利于细胞粘附。定量聚合酶链式反应（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明，BGS/I-LDH显著上调了成骨相关基因（BMP2, RUNX2, OCN）和蛋白的表达，并增强了ALP活性。茜素红S染色显示，BGS/I-LDH组钙结节沉积显著多于对照组和BGS组，证实其强大的体外促成骨分化与矿化能力。
体内抗骨肉瘤效应评估
在荷Saos-2瘤小鼠模型中，BGS/I-LDH在1270 nm激光照射下展现出优异的体内PDT效果，肿瘤生长被抑制了95.2%，且显著延长了小鼠的生存期。肿瘤组织的H&E染色、TUNEL凋亡染色和Ki-67增殖染色均证实了BGS/I-LDH+L组肿瘤组织发生了严重损伤、大量细胞凋亡和增殖抑制。血液学分析和主要器官H&E染色表明BGS/I-LDH具有良好的体内生物安全性。
原位骨肿瘤模型的抗瘤与成骨评估
在裸鼠胫骨原位骨肉瘤模型中，模拟临床手术切除后，植入BGS/I-LDH并进行激光照射，可显著抑制术后肿瘤复发。而其他对照组则观察到肿瘤快速复发和侵袭。微型计算机断层扫描（Micro-CT）结果显示，只有BGS/I-LDH+L组成功阻止了骨肉瘤复发，为后续良好的支架-骨整合创造了条件。
体内成骨特性评估
在新西兰大白兔的颅骨临界尺寸缺损模型中，植入BGS/I-LDH支架4周和8周后的Micro-CT扫描及三维重建显示，与BGS组相比，BGS/I-LDH诱导了更显著的骨再生和紧密的骨整合。定量分析表明，BGS/I-LDH组的骨体积、骨矿物质密度和总骨量在8周时分别达到了BGS组的3.8倍、3.0倍和11.4倍，效果显著优于以往报道的其他改性BGS。荧光双标（钙黄绿素-AM和茜素红S）及组织学染色（H&E、甲苯胺蓝、天狼星红）均进一步证实了BGS/I-LDH卓越的促进新骨形成和骨整合能力。
成骨性能机制探究
转录组测序分析发现，与BGS组相比，hBMSCs与BGS/I-LDH共培养后，有大量差异表达基因，其中与成骨密切相关的生物学过程显著富集。基因集富集分析（GSEA）显示Wnt信号通路在BGS/I-LDH组中被明显激活。后续的qPCR和Western blot实验在基因和蛋白水平上验证了Wnt/β-catenin/COL1信号通路关键分子（Wnt1, β-catenin, COL1A1, COL1A2）的表达均被BGS/I-LDH显著上调。体内免疫组化和免疫荧光染色也显示BGS/I-LDH组新生骨中I型胶原的表达更强。这些结果表明，BGS/I-LDH卓越的成骨性能可能归因于其持续释放的Mg2+和Zn2+离子激活了Wnt/β-catenin/COL1信号通路。此外，单细胞RNA测序分析显示，植入BGS/I-LDH支架两周后，局部细胞簇中成骨细胞、软骨细胞和巨噬细胞（尤其是M2型）的数量显著多于BGS组，从细胞层面验证了其优异的促成骨和免疫调节微环境的能力。
结论
总而言之，本研究成功开发了一种新型双功能支架BGS/I-LDH。其负载的I-LDH作为一种超分子光敏剂，在1270 nm激光照射下具有极高的单线态氧量子产率，赋予了支架高效的抗骨肉瘤能力。同时，支架能持续释放Mg2+和Zn2+离子，通过激活Wnt/β-catenin/COL1信号通路，并募集更多成骨相关细胞，从而发挥强大的促成骨作用。体内外实验均证实，BGS/I-LDH能有效抑制骨肉瘤复发并显著促进骨缺损修复，在术后骨肉瘤的综合管理与骨再生领域展现出巨大的临床应用潜力。
