利用免疫催化La?O?-Fe-Ni纳米酶结合ECL比色信号放大技术，检测食品基质中的猪胃蛋白酶

《Microchemical Journal》：Immunocatalytic La?O?-Fe-Ni nanozyme detection of porcine pepsin in food matrices through ECL-colourimetric signal amplifications

双模式免疫传感器基于La2O3-Fe-Ni纳米酶检测猪胃蛋白酶，结合比色法和电化学发光，具有低检测限和宽线性范围，机器学习预测分析验证了其在复杂食品样本中的有效性。

　　

Batrisyia Safwah Mohd Salleh | Fareeha Arshad | Koo Pey Ting | Minhaz Uddin Ahmed

生物传感器与纳米生物技术实验室，综合科学大楼，文莱达鲁萨兰大学理学院，Jalan Tungku Link，Gadong BE1410，文莱达鲁萨兰

摘要

食品中存在猪胃蛋白酶的现象在全球范围内非常普遍。尽管在宗教和纯素社区以及出于医疗考虑，这类成分被禁止用于食品中，但仍然难以确定它们在食品中的来源。食品行业中某些企业未能明确标注含有猪胃蛋白酶的食品，这需要本研究提供解决方案。在本研究中，我们报告了一种使用新型La₂O₃-Fe-Ni纳米酶的双模式检测猪胃蛋白酶的方法。该纳米酶表现出增强的过氧化物酶模拟活性，从而增强了产生的电化学发光信号。这种免疫传感器在两种检测模式下都能实现对猪胃蛋白酶的显著低限检测。结合机器学习技术，可以实现对猪胃蛋白酶的精确和准确预测。通过添加猪胃蛋白酶的食品样本进行了实际应用验证，结果表明该方法具有很好的回收效果。

创新性与影响

本研究开发了一种新型La₂O₃-Fe-Ni纳米酶，用于食品样本中猪胃蛋白酶的比色-电化学发光免疫检测。抗胃蛋白酶抗体与目标物质形成的免疫复合物通过磁力分离，仅允许特定的免疫复合物参与检测过程，从而无需使用阻断剂。免疫复合物直接滴加到微孔板的电极和孔上，省去了耗时的洗涤步骤和纳米酶、目标物质及抗体的逐层孵育过程，同时减少了来自阻断剂的噪声信号。此外，该纳米酶表现出显著的过氧化物酶模拟活性和动力学参数，优于辣根过氧化物酶及以往文献中报道的纳米酶。还建立了这些纳米材料的动力学参数（此前尚未进行过评估）。两种方法都实现了宽线性范围和低检测限，鉴于目前关于猪胃蛋白酶检测的研究较少（且现有方法通常检测限较高、检测范围较窄），这一点尤为有利。此外，机器学习被用于根据获取的数据集预测不同浓度的猪胃蛋白酶。

引言

胃蛋白酶普遍存在于许多脊椎动物体内，作为一种非特异性蛋白酶，几乎可以消化任何类型的蛋白质[1]。胃蛋白酶强大的消化能力使其能够水解蛋白质中的缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸残基的肽键，因此具有广泛的工业应用[2]。在皮革工业中，胃蛋白酶用于去除动物皮毛在鞣制前的脂肪和毛发等不需要的杂质[3]。它还广泛应用于食品制造过程中，包括制备植物和动物蛋白水解物以增加食品风味[4]、改变非乳制品零食中的植物蛋白[5]、将预煮谷物转化为即食热麦片[6]、改变明胶和大豆蛋白以获得发泡性能以及特定奶酪中的乳蛋白凝固[7]。最常见的胃蛋白酶来源是牛胃蛋白酶、微生物来源的胃蛋白酶和猪胃蛋白酶，它们占商业市场上酶的约60%[8]。 尽管胃蛋白酶在食品工业中具有多种用途和广泛的应用，但当食品中掺入来自猪来源的胃蛋白酶时，问题就出现了。猪胃蛋白酶是一种胃酸蛋白酶，由猪胃黏膜中的胃蛋白酶原衍生而来[9]。即使经过热变性和其他加工处理，这种酶仍可在加工食品中检测到[10]。猪胃蛋白酶在全球范围内被广泛用于切达奶酪的制造，通常与凝乳酶混合使用以生产优质奶酪[11]。然而，某些宗教群体禁止在食品中添加这类成分[12]，纯素社区也会避免使用，且对于某些有特定健康状况的人来说可能不适宜食用。因此，检测猪胃蛋白酶对于保护消费者健康、防止掺假行为和不道德的竞争行为至关重要，尤其是由于部分食品制造商的标签不准确。目前进口食品中猪胃蛋白酶的检测方法有限，例如聚合酶链反应（PCR）虽然灵敏快速，但存在非特异性引物结合、假阳性风险以及需要预先了解目标序列的问题。此外，食品成分也可能干扰DNA扩增[13]。 酶联免疫吸附测定（ELISA）是另一种用于食品分析的方法，具有灵敏度高、特异性强和快速的特点。但使用ELISA检测猪胃蛋白酶的研究存在一些局限性，如无法确定食品样本中猪胃蛋白酶的添加量以及对其敏感度较低[14],[15],[16]。最近的一项研究也使用ELISA（间接、非竞争性）对软奶酪的乳清和凝乳中的猪胃蛋白酶进行了定性检测，但未确定检测限，也未与实际生产的奶酪样本进行比较[17]。这两种方法都依赖于单一的检测信号，虽然ELISA通常具有较高的灵敏度，但其准确性无法交叉验证。解决这一局限性的一个可行方法是采用双模式传感器。这种方法结合了不同方法的优点，整合了双模式生物传感器中的多种信号输出，提高了准确性，允许使用少量样本，并提供了大量信息输出，同时保持了良好的特异性和灵敏度[18]。此外，这种方法有助于开发可重复、灵活且稳定的生物传感器，适用于现场检测。目前采用的双模式方法包括光学生物传感器、电化学/电化学发光（ECL）、光学-光学和光学-ECL[19]。 基于比色免疫传感器的光学检测因其众多优点而受到广泛关注，如高灵敏度、简单性、实时监测潜力以及直观的视觉检测[20],[21]。比色检测基于目标分析物存在时底物发生的可见颜色变化[22]。ECL免疫传感器结合了电化学和发光反应，通过将电能转化为光来实现分析物的免疫检测。ECL在医学诊断和食品分析领域表现出高灵敏度、快速测量能力和较宽的检测范围[23],[24],[25]。这两种方法都显示出良好的特性，但也存在各自的局限性，例如ECL的稳定性较低和准确性不高；此外，由于比色检测显示的颜色相同，可能会误检干扰分子，因此需要采用双信号输出策略[26],[27]。 双模式免疫传感器的核心是纳米酶（NZ）。纳米酶是人工合成的酶模拟分子，被认为是克服天然酶挑战的有希望的替代品[28]。基于金属氧化物的纳米颗粒（NPs）因其优异的生物相容性、化学稳定性以及纳米仿生结构和功能特性而成为NZ的理想选择[29]。FeNi合金因其出色的磁性质而在工业中得到广泛应用，可作为电催化剂，并具有确定的亲氧性和电负性[30],[31],[32]。 因此，将金属氧化物和FeNi合金纳米材料结合使用，可以实现协同的电催化功能，从而在双通道检测中增强其有益特性，主要通过比色-ECL传感策略实现。在本研究中，我们将La₂O₃与FeNi合金结合，设计了一种新型NZ，并将其与抗体（Ab）结合，以在每种检测模式下获得强烈的信号输出[33]。这种基于NZ的双模式免疫传感器在复杂食品样本中能够高效检测猪胃蛋白酶的存在。新型NZ基双模式免疫传感器表现出优异的催化性能、高选择性和灵敏度。

实验部分

本研究使用的材料、试剂和仪器的详细信息见补充文件S1。

三金属纳米酶的形态表征

使用的每种纳米材料的三维结构和表征通过扫描电子显微镜（SEM）进行评估。进一步表征通过能量色散光谱（EDS）完成。详细讨论见补充信息S2.1节。

双模式检测的反应参数优化

系统地优化了多个实验参数以提升传感器的性能。详细信息见支持文件。

两个变量之间线性关系和相关性的确认

为了进一步评估分布、相关性，并根据输入的猪胃蛋白酶浓度和吸光度响应预测目标浓度，采用了Scikit-learn中的线性回归算法。该算法简单、具有预测能力，适用于实时应用[65]。Scikit-learn通过数据可视化帮助算法分析，提高了结果的可解释性。

结论

本文通过引入三金属La₂O₃-Fe-Ni NZ，成功实现了猪胃蛋白酶的双模式免疫传感器检测。由于NZ出色的ECL-过氧化物酶模拟活性，比色和ECL模式下对猪胃蛋白酶的检测速度得到提升。在此之前，尚未评估这些纳米材料及其组合体的单独动力学参数。本研究显示，NZ的组合体具有优于单独组分的动力学参数。

CRediT作者贡献声明

Batrisyia Safwah Mohd Salleh：撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、方法论、研究、数据分析、概念化。 Fareeha Arshad：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据分析。 Koo Pey Ting：撰写 – 审稿与编辑、方法论、研究、数据分析、概念化。 Minhaz Uddin Ahmed：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、软件开发、项目管理、方法论、资金申请、数据分析。

资金来源

本研究部分得到了文莱达鲁萨兰大学（UBD/RSCH/URG/RG(b)/2023/036）和文莱研究委员会（Brunei Research Council）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

Batrisyia Safwah Mohd Salleh 感谢文莱教育部的研究生奖学金支持。