《Microchemical Journal》：Interpretable deep learning-empowered label-free SERS for predicting early recurrence of IgA nephropathy using MXene-based composite films
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本研究开发了一种基于MXene/AuNCs复合膜的表面增强拉曼光谱（SERS）与深度学习融合的非侵入性诊断方法，通过尿液分子光谱指纹分析实现IgA肾病（IgAN）复发的早期检测，诊断准确率达98%，并成功区分早期与严重复发阶段，发现CD89等尿液生物标志物的临床意义。
Dandan Fan|明星 Sui|艳华 Li|俊豪 Yu|青龙 Li|裴 马|学典 Zhang|慧 Chen
教育部光学技术与医学仪器重点实验室，上海科技大学，上海 200093，中国
摘要
移植肾脏中IgA肾病（IgAN）的复发率在30%到58%之间，对移植受者的长期生存构成重大威胁。早期发现复发可以及时进行有针对性的干预，从而显著改善移植物存活结果。迄今为止，IgAN复发的预测仍然具有挑战性。虽然反复进行肾脏活检对于监测疾病进展至关重要，但这种方法具有高度侵入性且存在固有风险。这凸显了迫切需要一种早期、可靠且无创的策略来监测IgAN复发并优化受者预后。在这项研究中，我们介绍了一种超灵敏且易于操作的诊断方法，该方法通过结合深度学习和表面增强拉曼光谱（SERS）在分子水平上分析IgAN患者的尿液样本。开发了由MXene和Au纳米立方体（AuNCs）组成的柔性复合薄膜作为SERS基底，具有高灵敏度和优异的生物相容性，能够获得尿液成分的分子光谱特征，从而反映IgAN引起的生理变化。通过深度学习模型成功分析了尿液成分的光谱特征差异，显示IgAN复发的诊断准确率为98%。同时，对于IgAN复发的患者，该模型通过定量评估光谱数据集之间的相似性来预测其早期复发。此外，我们还成功地对IgAN复发患者的尿液样本中的三种蛋白质（CD89、CD71和ASGP-R）进行了定量分析，发现早期复发和严重复发之间存在显著差异。这一分析突显了这些蛋白质作为当前IgAN诊断和监测生物标志物的临床意义。因此，将SERS与可解释的深度学习相结合，建立了一种新的IgAN复发诊断方法，不仅实现了出色的诊断性能，还通过SERS光谱分析显著提高了模型的可解释性。
引言
IgA肾病（IgAN）是全球最常见的原发性肾小球肾炎，大约40%的患者在诊断后10-20年内会进展为终末期肾病（ESRD）[1]。因此，IgAN患者构成了肾脏移植的重要候选人群。然而，研究表明，肾移植受体的IgAN复发率在30%到58%之间，IgAN复发对移植物的长期生存构成严重威胁[2]。早期识别高风险患者可以实现优化治疗并降低复发率。目前的监测策略依赖于血清肌酐、尿液蛋白定量和肾脏活检，但这些方法存在明显局限性。血清肌酐水平通常滞后于临床恶化，只有在肾小球滤过率（GFR）下降超过50%后才会升高，而反复活检的侵入性限制了其频繁监测的实用性[3]。更令人担忧的是，大约23%的组织学确认的早期复发患者没有症状，这表明传统监测方法可能会错过及时治疗的机会[4]。总体而言，这些诊断上的空白加剧了寻找能够检测IgAN早期复发并指导针对性干预的无创方法的研究努力。
基于尿液的无创检测已成为一个有前景的研究领域，因为它能够直接反映肾脏病理生理学并便于连续采样。然而，现有的无标记分析平台存在关键局限性：质谱技术尽管能够识别低丰度蛋白质，但在侵入性预处理步骤（如胰蛋白酶消化）过程中会丢失大量分子信息[5]；而色谱技术在检测微量炎症细胞因子和具有不同极性的分子时灵敏度不足[6]。最近的研究展示了使用生物传感器（如WaveFlex生物传感器）在分子水平上检测生物分子的应用[7]、[8]。近年来，表面增强拉曼光谱（SERS）通过无创检测、单分子灵敏度和分子特征特异性为生物医学分析提供了独特优势[9]。与需要外加探针的标记SERS不同，无标记SERS直接探测等离子体基底上的内在生物分子振动，从而能够对IgAN患者的尿液代谢物进行全面分析。
然而，将无标记SERS用于IgAN诊断面临两个关键挑战。首先，生物样本本身较弱的拉曼信号要求基底同时具备高SERS灵敏度和生物分子亲和力。虽然传统的金或银纳米颗粒由于其强烈的可见光谱范围内的局部表面等离子体共振（LSPR）吸收而被广泛用作拉曼增强剂[10]，但单个纳米颗粒的拉曼信号增强效果有限，这会抑制检测灵敏度。相比之下，精确组装的金属纳米颗粒可以通过增强电磁场产生更强的信号放大，这种现象通常称为热点，源于相邻纳米颗粒之间的纳米级间隙中的LSPR耦合[11]。尽管对金属纳米颗粒自组装进行了大量研究，但实现一致且可控的热点形成仍然是一个主要的技术挑战。最近，基于基底的自组装方法由于其操作简便性和对表面热点的更好访问性而受到关注。常用的支撑基底包括二氧化硅、纳米线、碳纳米管、石墨烯和黑磷[12]。值得注意的是，基于MXene的材料因其极高的表面积和丰富的表面官能团（如-OH、-F、-O）而成为有前景的替代品，这些官能团有助于有效吸附生物分子[13]。当与金属纳米颗粒结合时，MXene复合材料表现出增强的结构稳定性、改善的电子性能和协同的SERS性能。这种协同效应源于MXene的化学增强（CM）和金属纳米颗粒提供的电磁增强（EM）的结合[14]。
其次，从生物样本获得的SERS光谱由多种分子成分产生的重叠振动带组成，导致数据集复杂，无法使用传统的单变量分析方法充分分析。这种复杂性进一步加剧了区分健康个体和IgAN患者以及轻度与重度疾病阶段的必要性，因此需要先进的模式识别技术。为了解决无标记SERS光谱分析中的挑战，可以采用深度学习。深度学习算法在识别大型数据集中复杂的高维特征中的细微变化方面特别有效，并已成功应用于语音处理、自然语言理解和图像识别等领域[15]、[16]、[17]。最近，深度学习在生物数据分析（包括光谱信号）中也显示出有希望的结果[18]。得益于其分层的深度架构，深度学习能够进行多层次特征提取，有效识别并提取与目标问题相关的最有价值的信息[19]、[20]、[21]。然而，由于其复杂和非线性的本质，很难解释模型如何将输入数据转换为最终决策。这种固有的不透明性使深度学习被称为“黑箱”，特别是在医学背景下引发了重大担忧。迄今为止，将可解释的深度学习应用于SERS光谱数据的尝试仍然有限。采用这种可解释的技术进行SERS数据分析有助于协调高模型性能与对透明和可信人工智能的需求[22]。
在这项研究中，通过分析尿液样本的SERS光谱特征，并结合深度学习算法（图1），开发了一种快速且无创的IgAN复发诊断方法。合成了一种自支撑的Ti?C?Tx MXene/Au纳米立方体复合薄膜（称为MXene/AuNCs）。纯Ti3C2Tx MXene的底层赋予了薄膜优异的柔韧性和成本效益高的制备性能，而上层的MXene/AuNCs层通过相邻AuNCs的等离子体耦合以及Ti3C2Tx MXene与目标分子之间的电荷转移，增强了拉曼信号。使用MXene/AuNCs基底，从通过肾脏活检诊断为重度IgAN的患者的尿液样本中收集了SERS光谱（图1a）。来自多个尿液样本的光谱数据集被用来训练一个深度学习模型，以区分重度IgAN患者和健康对照组。模型架构和超参数经过迭代优化，以提高分类性能（图1b）。训练有素的模型在基于SERS数据区分重度IgAN病例和健康个体方面表现出高准确性，准确率为98%，AUC为0.98。为了解释模型的决策过程，采用了Grad-CAM技术来突出特征光谱峰。使用最终卷积层的输出，计算了梯度，并将其与特征图结合生成类别激活图，然后将其映射回原始光谱数据。这使得可以可视化对分类结果贡献最大的特定波数区域。此外，该模型还通过定量评估重度IgAN、轻度IgAN和健康对照组的数据集之间的相似性来预测轻度IgAN病例。此外，还定量分析了IgAN复发患者尿液样本中的三种蛋白质（CD89、CD71和ASGP-R）。其中，CD89显示出最高的临床相关性，可能是IgAN的关键生物标志物。
材料与试剂
所有使用的化学试剂和试剂均为分析级，所有实验均使用去离子水（18.25 MΩ·cm）。HAuCl?·3H?O、抗坏血酸和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）购自MACKLIN（上海，中国）。NaBH?购自上海新华化工试剂有限公司。Ti?C?Tx MXene少层分散溶液（3 mg/ml）购自上海胜希科技有限公司。
仪器
使用紫外-可见光吸收光谱仪记录数据
MXene/AuNCs薄膜的特性
MXene/AuNCs薄膜的制备过程如图2a所示。采用多步骤种子介导的生长方法合成了带有CTAB表面活性剂分子的带正电的AuNCs。合成的AuNCs具有高度单分散性和明确的立方形态，这一点通过透射电子显微镜（TEM）分析得到证实（图2b）。基于TEM成像对200多个颗粒的定量测量显示平均边长为50 ± 3.2 nm
结论
本研究提出了一种基于SERS光谱和深度学习的新型无创快速检测IgAN的方法。SERS技术的高灵敏度能够捕获与IgAN相关的尿液生物标志物细微表达变化的详细信息，而深度学习技术有助于从复杂的SERS光谱中提取潜在特征以支持IgAN的识别。MXene/AuNCs复合薄膜被用作SERS基底
CRediT作者贡献声明
Dandan Fan：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。Mingxing Sui：数据管理。Yanhua Li：数据管理。Junhao Yu：资源提供。Qinglong Li：形式分析。Pei Ma：监督。Xuedian Zhang：监督。Hui Chen：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
国家自然科学基金（62275156）。
