《Scientific Reports》：Highly sensitive profiling somatic mutations of thyroid cancer by nucleotide-enrichment-based MALDI-TOF MS assay
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为突破甲状腺细针穿刺(FNA)样本有限背景下，体细胞突变检测在灵敏度与通量上的瓶颈，研究人员开展了基于核苷酸富集-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(NE-MS)的甲状腺癌多突变检测研究。该技术通过选择性移除单碱基延伸反应中的野生型匹配ddNTP，将检测限(LOD)降至常规方法的1/8，实现了对26个甲状腺癌热点突变的同步、高灵敏识别，为甲状腺结节的诊断、治疗决策及预后评估提供了可靠的初筛与工具。
甲状腺癌是全球范围内最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在过去几十年中持续攀升。对可疑甲状腺结节进行准确诊断是临床管理的基石，而甲状腺细针穿刺(fine-needle aspiration, FNA)活检是当前术前评估的首选方法。然而，FNA样本往往量少质微，且约有20-30%的病例无法通过细胞学检查明确良恶性，这为精准诊断带来了巨大挑战。与此同时，随着分子病理学的发展，研究者们发现特定基因的体细胞突变与甲状腺癌的发生、发展、治疗及预后密切相关。例如，BRAFV600E、RAS家族、TERT启动子等突变不仅可作为诊断标志物，还能指导靶向治疗决策和预后分层。因此，对FNA样本进行高效、灵敏的多基因突变检测具有迫切的临床需求。
然而，现有的突变检测技术往往在灵敏度、通量、成本或多靶点同步检测能力上存在局限。传统Sanger测序灵敏度不足，而新一代测序(next-generation sequencing, NGS)虽然通量高，但成本昂贵、操作复杂、周期较长，难以在常规临床检验中作为快速初筛手段普及。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术因其快速、准确、自动化程度高等优点，已被用于基因分型和突变检测，但其检测灵敏度在面对样本中低频变异等位基因时仍有提升空间。如何在有限的FNA样本中，实现一种既高灵敏、高通量，又经济高效的多重突变检测，成为摆在研究人员面前的关键难题。
为了回答这一问题，一项发表在《Scientific Reports》上的研究提出了一种创新的解决方案。研究人员开发并验证了一种名为核苷酸富集-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Nucleotide Enrichment-assisted MALDI-TOF MS, NE-MS)的新型多重突变检测技术。该研究的核心目标是评估NE-MS在甲状腺癌26个体细胞热点突变检测中的性能，并探讨其在甲状腺结节诊断和预后评估中的临床应用价值。
作者为开展研究用到几个主要关键技术方法。首先，研究构建了针对26个甲状腺癌相关热点突变（涵盖BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、TERT启动子、EIF1AX、TP53等基因）的多重PCR引物池和单碱基延伸(single-base extension, SBE)探针。关键技术革新在于核苷酸富集(Nucleotide Enrichment, NE)步骤：在SBE反应中，通过加入修饰的链终止二脱氧核苷酸(dideoxynucleotide, ddNTP)并利用特定酶促反应，选择性地移除与野生型序列匹配的延伸产物，从而在质谱分析前富集突变型等位基因。随后，使用MALDI-TOF MS对延伸产物进行检测和质量分析。研究使用了来自甲状腺结节患者FNA样本的DNA进行方法学验证和临床性能评估。
NE-MS方法的原理与优化
研究人员详细阐述了NE-MS的技术原理。该方法在常规MS检测的SBE步骤后，引入了一个关键的NE过程。针对每个检测位点，设计使用质量修饰的ddNTP。通过一种酶促剪切反应，能够特异性地移除与野生型序列完成延伸的、带有特定质量标签的ddNTP产物，而保留了与突变型序列延伸的、未带该标签或带不同标签的ddNTP产物。这一过程实质上去除了大量野生型背景信号，使得后续MALDI-TOF MS检测时，突变等位基因的信号相对强度显著提高，从而实现了对突变等位基因的富集和灵敏检测。
NE-MS的灵敏度与特异性分析
通过使用梯度稀释的突变质粒与野生型基因组DNA混合样本，研究团队系统评估了NE-MS的检测限(limit of detection, LOD)。结果表明，NE-MS方法对多数测试突变的LOD低至0.125%的等位基因频率(allele frequency, AF)，而作为对照的常规MS方法的LOD为1% AF。这意味着NE-MS的检测灵敏度比常规方法提高了8倍。同时，该方法展现了良好的特异性，在野生型样本中未出现假阳性信号，表明其能准确区分野生型与突变型。
NE-MS在临床FNA样本中的验证
为了评估NE-MS的临床适用性，研究对一组已知突变状态的甲状腺FNA样本进行了盲法检测。NE-MS的结果与作为金标准的二代测序或数字PCR结果高度一致，显示出优异的诊断准确性。其敏感性(检出真阳性的能力)和特异性(检出真阴性的能力)均表现优异，证明了该方法在真实临床样本中可靠检测低频突变的能力。
NE-MS揭示的甲状腺癌突变谱与预后关联
利用NE-MS对更大规模的甲状腺癌FNA样本队列进行突变筛查，研究人员绘制了甲状腺癌的体细胞突变图谱。分析发现，除了常见的BRAFV600E和RAS突变外，TERT启动子突变、EIF1AX突变等也与甲状腺癌相关。更重要的是，通过随访数据分析，研究发现携带多种突变(例如BRAFV600E与TERT启动子突变共存)的患者，其临床病理特征更具侵袭性，无病生存期更短。这提示NE-MS检测出的多重突变谱可作为评估甲状腺癌患者预后的有力生物标志物。
NE-MS与其他检测方法的比较
研究还将NE-MS与常规MS、等位基因特异性PCR等方法进行了比较。NE-MS在保持高通量（可同时检测26个位点）和快速检测速度的同时，其灵敏度显著优于常规MS，并与一些高灵敏度的单一位点检测方法（如等位基因特异性PCR）相当，但通量更高。在成本方面，NE-MS相较于NGS更具优势，更适合作为临床大规模筛查的初选工具。
该研究的结论与讨论部分强调，本研究成功开发了一种名为NE-MS的新型、高灵敏度、高通量的多重突变检测平台。该技术通过创新的核苷酸富集策略，将MALDI-TOF MS的检测灵敏度提升了8倍，使其能够从极其有限的甲状腺FNA样本中，有效检测出低至0.125%等位基因频率的体细胞突变。NE-MS不仅能够同步准确检测26个甲状腺癌热点突变，为甲状腺结节的良恶性鉴别提供了一种强有力的分子诊断工具，而且其检测出的突变谱，特别是多重突变的存在，与患者的不良预后显著相关，从而使其也具备了预后评估的潜力。
这项研究的重要意义在于，NE-MS技术巧妙平衡了临床突变检测对灵敏度、通量、速度和成本的多重要求。它为解决FNA样本量少、传统方法灵敏度不足的临床难题提供了切实可行的方案。作为一款高效的初筛工具，NE-MS有助于实现甲状腺癌的早期精准诊断，指导个体化治疗决策（如对携带特定突变的患者考虑靶向治疗），并对患者进行风险分层管理，最终有望改善甲状腺癌患者的临床管理结局。该研究为将高性价比、高性能的分子检测推向常规临床实践提供了新的技术路径和坚实证据。
