《Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy》：NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions
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Glycans' structural diversity and dynamics in molecular recognition studied via NMR techniques.摘要：
萨拉·贝尔图齐（Sara Bertuzzi）|胡安·埃雷尼奥-奥尔贝亚（June Ere?o-Orbea）|安娜·希梅诺（Ana Gimeno）|马科斯·戈麦斯-雷东多（Marcos Gomez-Redondo）|胡安·C·穆尼奥斯-加西亚（Juan C. Mu?oz-García）|保拉·奥基斯特（Paola Oquist）|塞雷娜·摩纳科（Serena Monaco）|卢卡·乌尼奥内（Luca Unione）
西班牙塞维利亚大学化学研究所（IIQ），阿美里科·韦斯普西奥街49号，41092塞维利亚
摘要
糖链在自然界中无处不在，它们装饰着我们的细胞，并作为任何外来物质的初始接触点。这些糖链相互作用对于宿主-病原体识别至关重要，且与多种疾病（包括炎症和癌症）有关。因此，理解糖链的构象和动态以及调节其与蛋白质相互作用的关键特征对于设计新的治疗方法至关重要。由于糖链具有内在的灵活性，核磁共振（NMR）成为揭示这些特性的重要工具。在这篇综述中，我们描述了可以从不同实验中提取的关键NMR参数，这些参数可以帮助我们推断出必要的几何结构和分子运动信息，特别强调了评估糖苷键内部运动的重要性。我们具体讨论了从组织血型抗原到糖胺聚糖等各种天然糖链的NMR特性，同时也考虑了它们的合成类似物（糖模拟物）的特殊性质。最后，我们讨论了应用NMR协议来研究糖链相关的分子识别事件，既从碳水化合物的角度也从受体的角度进行了探讨，包括使用稳定同位素和顺磁NMR方法来克服糖链化学位移的固有简并性问题。
引言
糖链无处不在。从最简单的单糖到最复杂的糖结构，它们是地球上发现的最复杂的分子之一。根据组成它们的残基数，碳水化合物可以是单糖、寡糖或多糖，也可以与其他生物实体结合形成糖脂和糖蛋白等糖缀合物[1]。它们参与的大量生物过程使得理解它们在分子识别事件中的作用成为完全理解这些事件反应范围的关键[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。
由于糖介导的结合事件对细胞-细胞、细胞-基质和细胞-病原体之间的通讯至关重要，并且会精细调节细胞在健康和疾病状态下的生理功能，这一研究领域一直在不断扩展[3]。因此，理解碳水化合物的结构多样性、与其他生物分子的连接方式以及其在细胞内的分布至关重要。
单糖最常见的文本缩写方案使用三个字母，而它们的可视化表示方法则是普遍认可的所谓“糖链符号命名法”（SNFG）[7]，该方法为每个组成部分分配了一个精确的形状和颜色（图2）。
因此，自然界中观察到的多样性并不严格依赖于可用的糖构建块的数量，而是根植于单糖的化学复杂性和将它们连接在一起的不同类型的键。
本综述重点研究了控制糖链与凝集素之间结合事件的详细细节。多年来，一系列互补技术的发展使得能够在不同分辨率水平上对这些系统进行表征[8]。几十年来，X射线晶体学一直是用于阐明凝集素-糖复合物原子结构的最常用生物物理技术[9]、[10]。然而，由于糖链本身的灵活性，它们可能导致晶体不均匀性，从而限制了晶体的质量（分辨率）。糖链越大，获得高分辨率结构就越困难。实际上，这项技术存在一些普遍的限制，因为寻找正确的结晶条件可能需要大量的时间，而且并非所有蛋白质都能结晶。此外，已经证明沉积的糖-凝集素复合物结构可能需要进一步验证和优化，因为可能存在错误的构象或碳水化合物部分的错误连接[11]、[12]。
最近在冷冻电子显微镜（cryo-EM）方面的进展也提供了在原子水平上研究蛋白质-糖链识别的可能性[13]，克服了晶体生成相关的挑战。样品可以在玻璃化之前以低浓度制备。与X射线晶体学相比，冷冻电镜的一个巨大优势是构象灵活性不是障碍，原则上可以分析完整的糖蛋白，从而确定其原子的三维排列。然而，该技术的一个限制是尺寸；事实上，大约小于40 kDa的复合物很难被检测到。这对于高度糖基化的实体（如病毒、糖蛋白或糖脂）或多聚体组装或晶格（溶液中形成的三聚体、二聚体、四聚体）的研究没有问题，但无法详细分析小的凝集素-碳水化合物复合物[14]、[15]。
表面等离子体共振（SPR）[16]和生物层干涉测量（BLI）[17]是测量结合和解离动力学常数的生物物理技术。在这两种技术中，配体或受体都需要固定在传感器芯片上，但检测不需要额外的标记。这些技术可以用来研究凝集素-糖复合物，提供相互作用的热力学和动力学参数。然而，协议的优化可能具有挑战性。此外，其中一个组分固定在表面上可能会影响其与结合伴侣的适当呈现，这取决于具体的系统。
高通量微阵列也涉及在固体表面的固定[18]。这些方法是糖科学中用于快速检测结合事件并指导凝集素结合剂合理设计的基本工具。已经开发了糖链和凝集素阵列，可以在单次实验中同时测试数百种糖链或凝集素[19]。对于糖阵列技术，糖链通常通过共价方式固定在固体表面上[20]，通过荧光测量来检测结合事件。凝集素可以直接用荧光标签标记，或者通过使用荧光标记的抗凝集素抗体来进行检测。然而，这项技术也有一些限制。首先，大量的糖链在斑点中密集堆积，这在自然界中可能不会发生。此外，所使用的连接类型和长度以及表面的化学特性也会影响结合，主要影响糖链的方向、堆积和呈现方式[21]。
等温滴定量热法（ITC）提供了获得调节结合事件的热力学参数的独特方法[22]。不需要对配体或凝集素进行标记，而且检测方法的不断进步使得可以使用相对少量的样品进行实验[23]。此外，数据是在溶液中收集的，无需固定复合物的任何组分。通过绘制结合过程中释放的热量与配体浓度的关系图，可以准确计算结合常数（KD）、反应计量比（n）和识别过程的焓（ΔH）。此外，还可以间接估计熵（ΔS）。通常可以使用ITC研究亲和常数在nM-μM范围内的相互作用，大多数糖-凝集素结合都属于这个范围[24]。对于亲和力较低的系统，可以增加蛋白质浓度以优化实验。然而，亲和力在mM范围内的情况通常不适合确定可靠的常数[25]。
小节摘录
NMR的救援
由于自然界中单糖构建块的数量众多以及它们在溶液中的二面角构象可塑性，核磁共振（NMR）光谱已成为获取糖链构象细节的最佳方法，通常与计算程序结合使用。
NMR的多功能性提供了多种描述性参数（化学位移、耦合常数、NOE、弛豫率等），这些参数可以根据研究的核类型以多种方式加以利用。
天然糖链
早期的基于NMR的构象研究集中在组织血型寡糖和刘易斯抗原及其组成的二糖上[86]。当时在相对较低的磁场下对NOE数据的初步分析，加上特定的化学位移特征，表明这些分子具有相当明确的3D形状[87]、[88]。这一观点多年来一直被保留下来[89]，并且普遍认为这些分子
DOSY
鉴于糖链的复杂性和内在异质性，尤其是那些从天然来源分离出的糖链，确定其纯度和大小可能是一个真正的挑战。在许多情况下，扩散有序NMR光谱（DOSY-NMR）[236]可以用来推断所研究糖链制备的纯度，因为它能够结合原位平移扩散分辨率和光谱分析，而无需预先处理样品。
从分离的糖链到完整的糖蛋白
几十年来，糖蛋白的分析一直是NMR科学家面临的挑战。一般来说，糖蛋白中的糖链可以根据将它们连接到蛋白质链上的连接类型进行分类。N-糖链连接到天冬酰胺（Asn）的侧链酰胺基团，而O-糖链连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）的侧链羟基，或者较少见的情况下，连接到羟基赖氨酸（Hyl）的侧链羟基。还有罕见的S-和C-糖基连接，连接到半胱氨酸（Cys）
NMR与分子识别：糖链-受体相互作用
NMR光谱被广泛认为是分析不同复杂程度下配体-受体识别事件的稳健方法。有多种基于NMR的技术可用于评估分子相互作用，基本上可以分为两大类：从配体角度进行的NMR实验（基于配体的NMR实验）和从受体角度进行的NMR实验（基于受体的NMR实验）。
展望未来：NMR与计算的协同作用
像Rosetta这样的计算软件可以通过稀疏NMR数据得到非常有效的补充[685]。例如，添加顺磁NMR和氢-氘交换数据可以增强像AlphaFold2这样的程序通过NMR引导的Rosetta建模所完成的结构预测[686]。或者，粗粒度分子动力学（MD）模拟可以处理相当复杂的分子系统，并且可以用NMR数据进一步细化预测的结构，实现协同作用。对于糖科学而言简要总结
在这篇综述中，我们介绍了用于分配糖链NMR光谱和确定其化学性质的标准NMR协议。还描述了用于研究其构象和动态特征的NMR参数和实验方法，同时注意到了内部运动的影响以及糖苷键的固有化学特性。
CRediT作者贡献声明
赫苏斯·安古洛（Jesús Angulo）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，概念化。安娜·阿达（Ana Ardá）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学。萨拉·贝尔图齐（Sara Bertuzzi）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化。安赫莱斯·卡纳莱斯（Angels Canales）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化。胡安·埃雷尼奥-奥尔贝亚（June Ere?o-Orbea）：撰写——初稿，可视化，验证。安娜·希梅诺（Ana Gimeno）：撰写——审稿与编辑，利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了欧洲研究委员会（项目编号788143-RECGLYCANMR，资助对象J.J.-B）和玛丽-居里行动（ITN Glytunes项目协议编号956758，资助对象J.E.-O；以及ITN Glyco-N项目协议编号101119499，资助对象J.J.B.）的支持。我们还要感谢欧盟委员会对GLYCOTWINNING项目的支持，以及西班牙卡洛斯三世健康研究所（ISCIII，马德里）的CIBERES计划。同时感谢西班牙国家研究机构（Agencia Estatal de Investigación）提供的PID2019-107770RA-I00项目（资助对象J.E.-O.）的支持。
术语表
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DEEP-STD差异表位映射STD
DFT密度泛函理论
D-GlcAD-葡萄糖吡喃糖基
