《ACS Sensors》：Inexpensive High-Throughput Multiplexed Cytokine Detection for Tuberculosis Diagnostics Using Amplified Enzymatic Metallization
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本文推荐一种创新性低成本高通量多重细胞因子检测平台eMO-BEAM，该技术通过酶促银沉积放大信号，结合手机摄像头读取结果，可实现干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等关键细胞因子的亚皮摩尔级检测，为结核病（TB）潜伏感染（LTBI）诊断提供突破性解决方案，显著降低对专业实验室设备的依赖。
研究背景与诊断需求
结核病（TB）作为由结核分枝杆菌（Mtb）引起的重大传染病，全球约20亿人携带潜伏感染（LTBI），其中近千万人发展为活动性结核。当前结核诊断面临的核心挑战在于潜伏感染检测技术的局限性。干扰素释放试验（IGRA）作为主流检测手段，通过测量结核特异性抗原刺激后干扰素-γ（IFN-γ）的释放水平来识别感染，但其依赖昂贵仪器和专业实验室的特性严重制约了在资源匮乏地区的应用。近年研究表明，多重细胞因子检测（如联合检测IFN-γ、IL-2、TNF-α）可显著提升诊断准确性，但现有多重检测技术仍受限于高昂成本和仪器复杂度。
技术平台构建与优化
本研究开发了增强型多重光学生物检测平台（eMO-BEAM），以普通塑料培养皿为基底，通过激光切割聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜形成微孔阵列，构建低成本高通量检测体系。该平台的核心创新在于引入生物素化酪酰胺（biotinyl tyramide）信号放大级联反应：在辣根过氧化物酶（HRP）催化下，酪酰胺自由基共价结合至蛋白酪氨酸残基，沉积大量生物素位点，再通过多聚HRP-链霉亲和素（poly-HRP-SA）结合实现信号指数级放大。经优化，该技术将检测灵敏度提升100-1000倍，达到亚皮摩尔级别（IFN-γ：0.31 pM，IL-2：4 pM，TNF-α：0.42 pM）。
检测性能验证
在模型实验中，生物素-牛血清白蛋白（biotin-BSA）梯度稀释测试证实银沉积 darkness 与目标物浓度呈剂量依赖性关系。细胞因子检测实验中，eMO-BEAM对重组细胞因子的检测限显著优于传统ELISA（IFN-γ检测限从5600 pg/mL降至11 pg/mL）。在植物血凝素-L（PHA-L）刺激的人外周血单核细胞（PBMC）上清液中，该平台成功检测到不同刺激浓度下的细胞因子分泌梯度，且未刺激组背景信号较低，证明其对抗原特异性反应的良好识别能力。
临床样本应用分析
采用肯尼亚地区IGRA阳性和阴性临床样本进行验证，结果显示：在抗原（Ag1/Ag2）刺激条件下，IGRA+组三种细胞因子水平均显著高于IGRA-组。特别值得注意的是，IL-2在区分感染状态方面表现最优，其抗原刺激信号在IGRA+个体中持续高表达。TNF-α检测发现潜伏感染个体基线水平较高，符合该细胞因子在细菌免疫控制中的作用机制。通过建立细胞因子"指纹图谱"，可视化呈现不同感染状态的独特表达模式。
多重检测能力演示
通过设计双层PDMS结构（底层为4个1.5 mm捕获抗体微点，上层为6 mm公共样本反应池），实现单一样本中多重细胞因子同步检测。交叉实验证实各检测体系特异性良好，无显著交叉反应。在临床样本多重检测中，虽TNF-α信号较单重检测有所下降，但IL-2仍保持优异区分能力，证明平台的多重检测可行性。
技术优势与转化前景
相比传统ELISA和多重微球检测技术，eMO-BEAM将样本消耗量降至3 μL，仪器成本低于100美元（手机成像），每个检测成本约2.5美元。其干化学读模式摆脱了对光电仪器的依赖，通过开源手机应用即可完成结果量化。该平台为资源有限地区开展精准结核诊断提供了技术突破，且平台的可扩展性使其具备应用于其他疾病 biomarker 检测的潜力。
