《All Life》：Analysis of potential biomarkers and risk factors for rheumatoid arthritis with sarcopenia-osteomalacia based on 1H NMR technique: a case-control study
编辑推荐：
本研究运用1H NMR代谢组学技术，首次系统揭示了类风湿关节炎合并肌少症-骨软化症（RA-OP）患者血清代谢网络的紊乱特征，并关联临床指标验证了骨代谢标志物（CTX、PINP、维生素D、OST、IGF-1）及13种潜在代谢物（如α-酮戊二酸、柠檬酸等）的诊断价值。文章深入探讨了RA-OP患者能量、氨基酸、脂质代谢异常与骨-肌肉轴信号通路（如RANKL、PI3K-Akt、mTORC1/S6K1等）的关联，为早期筛查、精准分层及干预提供了新的代谢视角和量化工具。
引言
类风湿关节炎是一种全球患病率约0.5%–1.0%的自身免疫性疾病，在中国患者超过500万。尽管达标治疗策略显著延缓了关节结构损伤，但仍有13%–32%的患者会发展为继发性骨质疏松，导致髋部和椎体骨折风险倍增。骨质疏松合并肌少症常构成“骨肌减少症”，加剧跌倒、失能和死亡风险。胰岛素样生长因子-1和维生素D是骨-肌肉轴的关键介质，但在炎症和糖皮质激素的双重打击下其浓度迅速下降，限制了现有指标的预测能力。因此，迫切需要能够抵抗炎症波动、同时反映成骨、肌生成和线粒体功能的新型代谢组学面板，用于RA-OP的早期检测和精准分层。
病例与试剂
本研究病例来源于广州中医药大学东莞医院风湿科2022年10月至2024年10月的门诊及住院患者。其中，单纯RA组24例，RA合并肌少症-骨代谢异常组40例。RA诊断采用1987年美国风湿病学会或2010年ACR/EULAR分类标准。骨质疏松诊断依据骨密度测量，采用双能X线吸收测定法评估腰椎区域。肌少症诊断参考中国专家共识。研究获得了东莞市中医院伦理委员会的批准，所有受试者均签署知情同意书。
实验与方法
采集患者血清样本，使用布鲁克500 Hz超低温探头核磁共振波谱仪在25°C下进行1H NMR检测。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列获取谱图。原始数据进行相位和基线校正后，使用MestReNova软件进行分析，将化学位移δ 0.5–9.0区域自动积分。数据进行归一化处理后，导入SIMCA-P+ 14.0软件进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等多元统计分析。通过受试者工作特征曲线评估生物标志物的诊断效能。
结果
研究队列的基本特征
两组患者在性别、年龄、CCP抗体、RF、CRP和ESR方面无显著差异。然而，RA-OP组的病程、前一年激素使用比例、简易躯体功能评估、6分钟步行测试、5次椅子坐立测试、平衡测试、骨代谢指标以及IGF-1水平均显著高于单纯RA组。ROC曲线分析显示，骨代谢指标CTX、PINP、维生素D、骨钙素和IGF-1可作为区分RA-OP与单纯RA的早期筛查标志物。相关性分析表明，IGF-1和维生素D与骨骼肌质量指数呈正相关，而CTX、PINP和骨钙素与SMI呈负相关。
RA与RA-OP组的血清代谢物分析
OPLS-DA分析显示两组样本区分明显，模型有效。最终筛选出43种差异代谢物。火山图分析显示，与单纯RA组相比，RA-OP组3-羟基丁酸、VLDL/LDL、苯丙氨酸、乙酸、甘油、肌醇、肌酐、马尿酸、牛磺酸、脯氨酸、甜菜碱、乙醇、乙酸和赖氨酸水平升高；而HDL、α-酮戊二酸、丙氨酸、丙二酸、丙二醇、丙酸、丙酮酸、大豆黄酮、胆碱、丁酸、二甲胺、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、蛋氨酸、酪氨酸、亮氨酸、磷脂酰胆碱、柠檬酸、前列腺素D2、羟基丁酸、乳酸、苏氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和异亮氨酸水平降低。
RA-OP潜在生物标志物的ROC分析
通过ROC曲线评估了13种潜在代谢生物标志物的诊断效能。α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸、丁酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸的曲线下面积均高于0.94，显示出优异的区分能力。而苏氨酸和脯氨酸的AUC值较低。
潜在代谢通路分析
对筛选出的差异代谢物进行通路富集分析，鉴定出12条显著改变的代谢通路。这些通路涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成与降解；乙醛酸和二羧酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；丙酮酸代谢；糖酵解/糖异生；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；柠檬酸循环；苯丙氨酸代谢；精氨酸生物合成；丁酸代谢；以及泛酸和辅酶A相关代谢通路。这些代谢网络的异常可能导致葡萄糖、脂质和氨基酸代谢紊乱，影响活性氧代谢，并涉及RANKL、PI3K-Akt、Nrf2、mTORC1/S6K1和Wnt/β-catenin等多条信号通路。
RA-OP差异代谢物与临床指标的相关性分析
为增强诊断预测模型，进行了代谢物与临床指标的相关性分析。在13种主要潜在诊断代谢标志物中，丙氨酸与CTX呈负相关；苯丙氨酸和脯氨酸与PINP呈显著正相关；缬氨酸与PINP呈显著负相关；八种代谢标志物与维生素D呈正相关，其中丙氨酸相关性显著；苯丙氨酸与OST呈显著正相关，而苯缬氨酸与OST呈显著负相关；亮氨酸与IGF呈显著正相关；苏氨酸与SMI呈显著正相关；三种代谢标志物与RF呈负相关。
讨论与结论
研究表明，RA-OP患者处于高骨转换状态，CTX、PINP和骨钙素水平升高。维生素D作为保护因子影响RA患者的骨密度水平。肌少症是RA的重要并发症，与疾病活动度、病程和RF水平相关。尽管激素治疗可减轻炎症引起的骨丢失，但也会增加骨质疏松风险并加速肌肉蛋白质分解。
本研究设计了一个遵循“炎症-能量-骨-肌肉”轴的分层分析流程。首先采用非靶向NMR代谢组学无偏倚地捕捉线粒体和氨基酸扰动。其次测量五种常规骨代谢标志物。第三使用生物电阻抗分析法衍生的骨骼肌质量指数量化肌肉质量。最后计算累积糖皮质激素剂量以排除其混杂效应。结论通过三步得出：发现阶段，OPLS-DA筛选出13种候选代谢物；验证阶段，Delong检验显示组合逻辑模型的诊断效能优于任何单一标志物；混杂控制阶段，经过倾向评分匹配后，生物标志物的排序保持不变，证实其独立于类固醇暴露。
研究发现RA-OP患者的激素累积使用时间和最大日剂量更高。所有五种骨转换标志物均能区分RA-OP与单纯RA患者。在13种候选代谢物中，α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸、丁酸和丙氨酸这五种满足AUC≥0.97且VIP≥1.5，被指定为“一级候选物”。成本效益模型预测，采用α-酮戊二酸+柠檬酸作为血液预筛查可将DXA转诊减少42%，同时保持对RA-OP的90%灵敏度。
IGF-1缺陷可能导致全身性胰岛素抵抗和骨特异性胰岛素抵抗，进而通过骨钙素调节骨代谢、葡萄糖稳态和能量代谢。本研究发现柠檬酸和α-酮戊二酸等代谢物与IGF-1降低和OST升高相关，表明RA合并肌肉萎缩患者可能存在异常的IGF-1代谢。
代谢组学分析初步得出结论，潜在生物标志物可能是α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸、丁酸、丙氨酸和谷氨酸。研究发现柠檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸减少，这可能涉及柠檬酸循环和丁酸代谢两个过程。RA-OP患者柠檬酸水平较低而疾病活动度较高，且与维生素D呈正相关，提示该通路或可用于评估疾病活动度。
在炎症微环境中，环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶的表达，以及骨髓间充质干细胞分化的抑制，可能与线粒体自噬有关。RA-OP患者表现出脂质代谢异常，乳酸脱氢酶和甘油水平显著升高。泛酸可能通过清除活性氧生成来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。
研究发现RA-OP患者氨基酸代谢通路异常，主要涉及精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢；以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。与丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路相关的五种生物标志物水平降低。研究表明谷氨酸可重塑破骨细胞前体，诱导M2样巨噬细胞分化，缓解骨丢失症状。谷氨酸代谢通路还与肌少症相关，可能涉及mTORC1/S6K1通路激活和活性氧水平。
与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路相关的四种指标水平降低，而甘氨酸和苏氨酸水平升高。磷酸化丝氨酸受体可能不仅促进细胞外信号调节激酶和Akt激活介导的成肌细胞增殖和细胞周期进程，还有助于磷脂酰丝氨酸依赖的成肌细胞融合。丝氨酸被发现能以Wnt/β-catenin依赖性方式促进成骨并抑制脂肪生成。
研究中观察到RA-OP患者血清异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸水平降低，同时6分钟步行测试等体能表现下降。然而，单独补充支链氨基酸可能无法有效改善肌少症。亮氨酸能够激活骨质疏松小鼠的Wnt/β-Catenin通路，从而促进骨骼生长。
研究发现RA-OP患者苯丙氨酸水平升高，酪氨酸水平降低。因此，限制苯丙氨酸摄入可能有益于预防骨质疏松。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成受损也可能影响肌少症。
在RA-OP患者中，观察到脯氨酸水平升高伴随谷氨酸水平降低，表明精氨酸生成通路受阻。先前研究表明，脯氨酸等特定氨基酸的减少可能导致胶原诱导性关节炎模型小鼠的巨噬细胞极化失衡并增强炎症反应。对骨质疏松小鼠的研究表明，谷氨酸和精氨酸能显著增强股骨的骨重量、骨量指数、骨矿物密度和骨硬度。精氨酸还与肌少症有关，摄入富含精氨酸和胱氨酸的食物以及补充动物源优质蛋白可能有助于预防肌少症。
机制探究揭示，RA-OP患者的肌少症主要源于骨质疏松而非炎症。在低炎症亚组中，RA-OP受试者的四肢骨骼肌指数仍显著较低。泛素连接酶MuRF-1和atrogin-1的水平与血清骨钙素呈负相关，但与CRP水平无关，表明骨-肌肉内分泌轴是主要的分解代谢驱动因素。这些发现共同支持了RA-OP患者肌少症发病机制中“骨质疏松主导，炎症助推”的范式。
本研究是一项单中心回顾性研究，样本量相对较小。根据“每个变量至少10个事件”的经验法则，12个候选代谢物对应40个阳性事件，事件数与变量比仅为3.3，远低于推荐阈值。因此，任何具有统计学显著性的生物标志物应被视为“探索性”而非“确定性”的。有限的样本量也降低了亚组分析的功效。
总之，本研究提出了一套血清“骨-肌肉能量轴”生物标志物组合，将RA-OP中骨骼和肌肉隐匿的协同侵蚀转化为可量化的早期预警系统，并概述了一个易于实施的筛查-分层-监测框架，该框架可扩展至其他继发性骨质疏松人群。
局限性
尽管利用代谢组学发现了与类风湿关节炎合并肌少症-骨软化症相关的多条代谢通路，并基于文献推断其与RANKL、PI3K-Akt、Nrf2等多条影响成骨细胞和成骨分化的通路相关，但需要更多实验来验证这一结论。由于伦理考虑，难以获取临床患者样本进行验证。因此，未来计划进行额外的动物实验来验证假设并指导该疾病的预防。
