《Biotechnology & Biotechnological Equipment》：Genome-wide characterization and expression analysis of the YUCCA genes in castor (Ricinus Communis L.)
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本研究首次在重要油料作物蓖麻中全基因组鉴定了9个YUCCA（RcYUC）基因，通过系统进化、保守结构域及表达模式分析，揭示RcYUC4、6、10a在种子中高表达，为解析蓖麻内源生长素（IAA）生物合成机制及提高种子产量提供了关键靶点。
ABSTRACT
生长素在植物生长发育的各个阶段都起着至关重要的作用。蓖麻是一种具有巨大潜力的重要油料和生物能源作物。然而，关于蓖麻中生长素的研究很少，该植物内源生长素的合成过程仍然未知。本研究拟利用拟南芥YUCCA（AtYUC）蛋白的氨基酸序列作为查询序列，在蓖麻基因组数据库中进行BLAST搜索。在蓖麻基因组中共鉴定出九个YUCCA-like基因（命名为RcYUCs）。随后对这些RcYUCs进行了基因结构、保守结构域和系统进化分析。通过实时荧光定量PCR（RT–qPCR）确定了RcYUCs的表达模式。RcYUC蛋白的平均长度和相对分子量分别为402个氨基酸和44.99 kDa，均为两性蛋白。此外，发现RcYUC蛋白含有保守的黄素单加氧酶（FMO）基序。在种子中观察到RcYUC4、6和10a基因的高表达，表明其在种子发育中具有重要作用。这些发现为进一步研究RcYUCs基因功能奠定了基础。
Introduction
生长素是第一个被发现的植物激素，参与许多植物生长发育过程，包括细胞分裂、分化和伸长、维管组织分化、根的形成、向性生长、顶端优势、繁殖和果实发育。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物中最重要的内源生长素。IAA生物合成涉及色氨酸（Trp）依赖性和Trp非依赖性途径。已知有四条Trp依赖的IAA生物合成途径：吲哚-3-乙酰胺（IAM）途径、色胺（TAM）途径、吲哚-3-丙酮酸（IPA）途径和吲哚-3-乙醛肟（IAOx）途径。IAM途径在植物中广泛存在，但IAM的产生机制仍不清楚。IAOx途径存在于少数植物中，涉及CYP79B家族蛋白。TAM途径已在拟南芥中被鉴定，并可能在豌豆的生长发育过程中发挥作用；然而，其在其他植物中的存在仍不清楚。IPA途径是植物中第一个被完全表征的生长素合成途径，并且是大多数植物中主要的IAA合成途径。IPA途径使用色氨酸作为前体。首先，色氨酸的氨基被色氨酸转氨酶（TAA）去除，形成吲哚-3-丙酮酸（IPA）。然后，IPA通过黄素单加氧酶（FMO）介导的催化作用被氧化和脱羧生成IAA。这种生长素生物合成途径在整个植物界高度保守，并且对几乎所有的发育过程都至关重要。催化IPA形成IAA的FMO由YUCCA（YUC）基因家族编码，是IPA途径中的限速酶。拟南芥YUC基因家族包含11个成员：AtYUC1–11。研究表明，YUC基因主要在拟南芥的分生组织、未成熟原基、维管组织和生殖器官中表达；这些基因对于胚胎发生、幼苗发育、维管组织分化和花发育至关重要。每个YUC基因的过表达都会导致生长素的过量产生，而YUC基因中的T-DNA插入突变则会导致生长素缺乏表型。YUC基因广泛分布于植物基因组中，其功能是保守的。YUC基因家族已在不同植物物种中得到广泛研究。玉米、水稻、矮牵牛、黄瓜和林地草莓中YUC基因的突变会导致严重的发育缺陷，表明YUC基因对于单子叶植物和双子叶植物的发育都是必不可少的。
蓖麻是一年生或多年生灌木。作为世界十大油料作物之一，广泛用于化学、能源、农业、医药和纺织工业；因此，蓖麻具有很高的经济价值。从蓖麻种子中提取的蓖麻油是一种重要的化工原料和潜在的生物能源。此外，它也是唯一可用于航空的植物油。随着全球石油资源日益稀缺，对蓖麻油的需求正在增长。然而，蓖麻种子产量不足以满足生产需求，提高其产量的方法研究正受到全球越来越多的关注。
生长素是植物生长和繁殖的重要调节因子，因此，研究蓖麻生长素生物合成可能有助于我们通过基因工程提高蓖麻产量，为改善蓖麻各种重要农艺性状奠定基础。在本研究中，我们使用AtYUC序列作为模板，在蓖麻中筛选并鉴定了YUCCA-like基因（命名为RcYUCs）。分析了RcYUCs的基因结构、表达模式、保守功能蛋白结构域和系统发育。这项研究为进一步研究RcYUCs在生长素合成中的功能提供了基础。
Materials and methods
Bioinformatics analysis
从TAIR数据库下载AtYUC序列。通过关键词搜索和使用AtYUC蛋白序列进行Blastp（blastp），从Phytozome、GenBank和蓖麻基因表达数据库Castor DB中获取RcYUC序列。玉米ZmYUC和水稻OsYUC序列分别从maizeGDB和Rice Genome Annotation Project（RGAP）获得。使用GSDS2.0分析基因结构。使用Pfam和CDD鉴定保守结构域。使用MEGA7软件中的ClustalW工具对YUC蛋白序列进行比对。使用邻接法构建系统发育树，并进行1000次bootstrap重复。
Plant materials and growth conditions
本研究中使用的蓖麻种子是在中国新疆收获的‘华泰’杂交种。在滤纸上发芽后，将幼苗在培养箱中的水中培养2周，光照/黑暗周期为16小时/8小时，温度为22°C。然后将幼苗移植到中国天津南开大学的试验田，在自然光照、温度和湿度条件下生长。为了获得不受土壤颗粒污染的高质量根样本，我们使用水培系统收集幼苗的根。具体来说，在滤纸上发芽后，从水培的幼苗中收集根。从土壤中生长的两叶期植物中收集茎和叶。从土壤中生长的开花植物中收集雌花、雄花和幼嫩种子。所有样品均使用镊子或剪刀通过手动解剖收集，然后在液氮中冷冻用于后续实验。
Qualitative real-time PCR (RT–qPCR) analysis
将100 mg新鲜的蓖麻样品（包括叶、根、茎、雌花、雄花和种子（从正常条件下生长的蓖麻幼苗或植物中收集）在液氮中研磨成细粉。使用北京全式金生物的RNA提取试剂盒（ET121）提取总RNA。使用北京全式金生物的反转录试剂盒（AE301）将1 μg总RNA反转录成cDNA。使用NanoDrop测量RNA浓度。通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量，并使用内参基因RcACTIN7（LOC8273907）的引物通过PCR扩增确定cDNA质量。使用Primer 5.0软件设计RcACTIN7和所有靶基因的RT-qPCR引物，标准如下：扩增子长度80?200 bp，引物长度18?22个核苷酸，熔解温度（Tm）为58?62°C。为避免基因组DNA扩增，尽可能设计跨外显子-外显子连接处的引物。通过熔解曲线分析中的单峰和琼脂糖凝胶电泳确认每个引物对的特异性。所用引物列于补充表1。RT–qPCR反应混合物包含7.5 μL 2xSYBR Green Mix，0.5 μL正向和反向引物（10 μM）各，1 μL cDNA，和5.5 μL ddH2O（总体积15 μL）。扩增的Tm值为57oC。PCR包括40个循环。使用2???Ct（Ct，循环阈值）值计算基因的相对转录水平。进行了三个独立的生物学重复，每个重复由跨不同采样场合获得的混合植物组织提取的RNA生成。使用单尾Student’s t检验确定统计学显著性；P < 0.05被认为具有显著性。
Results
Identification and characterisation of the castor YUCs
为了鉴定蓖麻中同源的YUC基因，从TAIR数据库下载了11个AtYUC蛋白的氨基酸序列，并用作BLAST搜索的查询序列。我们搜索了Phytozome、NCBI和蓖麻基因表达数据库RcDB，鉴定出九个候选基因。根据它们与AtYUCs的同源性，将这些RcYUCs命名为RcYUC2、RcYUC3、RcYUC4、RcYUC5、RcYUC6、RcYUC10a、RcYUC10b、RcYUC11a和RcYUC11b。然而，在蓖麻中没有发现AtYUC1、7、8或9的同源物。值得注意的是，AtYUC10蛋白与RcYUC10a和RcYUC10b蛋白的相似性分别为54.29%和47.66%，AtYUC11蛋白与RcYUC11a和RcYUC11b蛋白的相似性分别为55.84%和53.69%。
分析了推定的RcYUC蛋白的基本物理和化学性质。平均蛋白长度和分子量分别为405个氨基酸和45.29 kDa。RcYUC6表现出最长的氨基酸序列（435个氨基酸），相对分子量为48.59 kDa。最短的氨基酸序列出现在RcYUC10b（377个氨基酸），相对分子量为41.9 kDa。理论等电点（pI）范围从6.94到9.33。RcYUC4、RcYUC10a、RcYUC10b、RcYUC11a和RcYUC11b的不稳定指数（II）低于40，表明这些蛋白是稳定的。RcYUC家族的总平均亲水性（Gravy）范围从-0.5到0.5，并且都是两性的。
RcYUCs and AtYUCs phylogenetic and gene structure analysis
我们对RcYUCs和AtYUCs的氨基酸序列进行了多重比对，并使用MEGA7构建了系统发育树，表明YUC家族根据同源性可分为四个进化枝（A、B、C和D）。RcYUC2、6和AtYUC2、6聚集在进化枝A中，RcYUC4和AtYUC1、4聚集在进化枝B中，RcYUC3、5和AtYUC3、5、7、8和9聚集在进化枝C中，RcYUC10a-11b和AtYUC10、11聚集在进化枝D中。根据之前的报道，同一进化枝的AtYUC基因表现出相似的表达模式。在基因结构分析中，具有相似结构的基因聚集在系统发育树的相同分支。RcYUC2、RcYUC4、RcYUC6、RcYUC10b、RcYUC11a、RcYUC11b包含四个外显子和三个内含子。RcYUC3和RcYUC5有三个外显子和两个内含子，而RcYUC10a有五个外显子和四个内含子。
为了进一步分析YUC蛋白的系统发育，我们在8种植物中鉴定了89个同源YUC蛋白：拟南芥、烟草、水稻、玉米、木薯、橡胶树、麻风树和蓖麻。对蛋白序列进行比对，并使用MEGA 7.0构建系统发育树。结果显示，所有YUCs聚集成四个亚组。此外，在每个亚组内，双子叶植物和单子叶植物的YUCs分别聚集。
Conserved domain analysis of RcYUC proteins
使用DNAMAN 7.0对RcYUCs和AtYUCs的氨基酸序列进行比对，揭示了蓖麻和拟南芥YUC序列之间的高度相似性。为了研究这些YUC蛋白是否含有FMO功能结构域，我们进行了NCBI保守结构域分析，并使用Pfam结构域分析程序评估了RcYUCs和AtYUCs的氨基酸序列。发现所有这些蛋白都包含FAD结合基序（GxGxxG）、GC基序（ExxxxxAS）、含ATG的基序1（YxxxxxxATGENxxxxxP）和基序2（DxxxxATGYxS）、FMO识别基序（FxGxxxHxxxF/Y）和NADPH结合基序（GxGxxGME）。据推测，GC基序有助于稳定FAD结合。含ATG的基序1充当FAD结合基序和NADPH结合基序之间的桥梁。FMO识别基序有助于NADPH结合，含ATG的基序2提供了NADPH位点和活性位点之间的连接。
Expression pattern of RcYUCs
我们分析了RcYUCs在根、茎、叶、雄花、雌花和种子等不同组织中的表达，以研究它们的功能。发现RcYUC2在雄花中特异性表达。RcYUC6和RcYUC10a在种子中特异性表达，并显示出相似的表达模式。在其他被检测的组织中均检测到其余RcYUC基因的转录，其中RcYUC4在雌花和种子中高表达，RcYUC3在雄花和种子中高表达，RcYUC5在根中高表达，RcYUC10b在根和茎中高表达，RcYUC11a在叶和雌花中高表达，RcYUC11b在种子中高表达。然后，我们以RcYUC4的表达为标准，计算了其他RcYUC基因在不同组织中的相对表达。在种子中特异性表达的RcYUC10a在这些基因中表现出最高的表达。RcYUC11a和RcYUC11b在所有被检测组织中的表达水平相对较低。
Promoter sequence analysis of RcYUCs
所有九个RcYUC基因的启动子都含有光响应性BOX4顺式作用元件。此外，其他光响应元件如AE-box、AT1-motif、GATA/TCCG-motif、I-box、O2-site、P-box和TCT-motif广泛分布于各种RcYUC基因的启动子中。这些结果表明，这九个RcYUC基因可能在植物光响应中发挥重要作用。此外，RcYUC基因的启动子含有多种激素响应元件。RcYUC2和RcYUC5的启动子含有脱落酸响应元件ABRE；RcYUC4、RcYUC10a和RcYUC11a含有赤霉素响应元件GARE-motif；RcYUC2、RcYUC5、RcYUC10a、RcYUC10b和RcYUC11a的启动子含有茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif。此外，RcYUC4、RcYUC5和RcYUC11b含有水杨酸响应元件TCA-element。这些发现表明，RcYUC基因家族可能参与植物对多种激素的响应，在激素介导的植物生长发育和胁迫响应中发挥作用。关于胁迫响应，RcYUC基因也可能参与对逆境的适应。如图所示，RcYUC4、RcYUC5、RcYUC10b和RcYUC11a的启动子含有干旱诱导元件MBS；RcYUC2和RcYUC5的启动子具有低温响应元件LTR；RcYUC11a的启动子含有防御和胁迫响应元件TC-rich repeats。这些结果表明，这些基因可能有助于植物对非生物胁迫的响应，增强对干旱、低温和其他不利条件的耐受性，并提供对生物胁迫的防御机制。
Discussion
使用AtYUC蛋白的氨基酸序列作为模板，我们鉴定出九个候选RcYUC蛋白。结合系统进化分析结果，我们将这些基因命名为RcYUC2–6、RcYUC10a、RcYUC10b、RcYUC11a和RcYUC11b。对该基因家族进行了基因信息注释、基因结构、保守功能结构域和系统进化分析，为进一步阐明RcYUCs的功能奠定了基础。在序列分析中未发现蓖麻中存在与AtYUC1、AtYUC7、AtYUC8或AtYUC9同源的序列，表明这些基因可能在物种进化过程中丢失了，然而，AtYUC3、AtYUC4和AtYUC5的同源物RcYUC3、RcYUC4和RcYUC5被保留下来，并显示出密切的进化关系。由于YUC家族的功能冗余，这种进化可能不会对相应功能产生影响。然而，蓖麻中有两个AtYUC10和AtYUC11的同源物，表明这些基因可能在进化过程中发生了复制。YUC基因家族的表达特征已在两种主要油料作物大豆和油菜中进行了研究。油菜是一个异源四倍体，经历了全基因组复制，这是油菜中YUC基因家族成员数量（57个）远多于大豆（22个）的关键原因。更多的基因拷贝也为功能分化提供了基础。YUC蛋白是NADPH和FAD依赖的FMO酶，可以将羟基转移到含有亲核杂原子的低分子量底物上。FMO蛋白的保守基序包括FAD结合基序、GC基序、NADPH结合基序和含ATG基序。我们发现几乎所有的RcYUC蛋白都含有上述基序，表明它们可能具有与AtYUCs相同的功能。YUCs是IAA生物合成途径中的限速酶；它们的过表达会导致IAA过量产生表型，包括根短、根毛长、顶端休眠减少和植株增高。为了验证RcYUCs的功能，下一步是在拟南芥中过表达它们，并确定转基因植物是否表现出生长素过量产生的表型。
RT–qPCR显示RcYUC4、RcYUC6和RcYUC10a在种子中高表达。先前的研究表明，AtYUC1和AtYUC4的表达在整个胚胎发育过程中的不同细胞群中存在差异。这些基因与玉米中的ZmSPI1和水稻中的OsYUC1同源；ZmSPI1和OsYUC1对于玉米的营养和生殖发育是必需的。草莓中的FveYUC4在幼叶和花蕾中特异性表达，其突变导致果实小和胚胎败育。我们推测RcYUC4、RcYUC6和RcYUC10a可能在蓖麻种子发育中起关键作用。RcYUC10a在幼嫩的蓖麻种子中特异性表达，在所有YUCs中表达水平最高。作为调节细胞分裂和伸长的重要植物激素，生长素在控制种子大小方面起着关键作用。例如，在种子壳中特异性表达AtYUC8的转基因拟南芥植物比野生型产生更大的种子。拟南芥的MATERNAL EFFECT EMBRYO ARREST45（MEE45）可以通过下游AINTEGUMENTA（ANT）基因调节关键生长素生物合成基因AtYUC4的表达，从而影响母体组织中的细胞增殖，并最终决定种子大小。通过构建豆类作物的泛基因组图谱，阐明了YUC基因，特别是趋同选择基因GmYUC4，在豆类作物驯化和改良过程中对种子大小（一个关键产量性状）的调控作用。类似地，在世界范围内重要的油料和经济作物花生中，荚果和籽粒大小是影响产量和外观品质的关键因素。研究人员发现了一个黄素单加氧酶样基因AhPDS1，它通过IPA途径参与IAA生物合成来调节种子大小，并且位于与荚果和籽粒大小相关的染色体上的一个多效性热点区域，表明其可能间接影响油产量。在微藻的早期稳定期添加IAA可显著增加总脂质含量并改变脂肪酸组成（增加饱和脂肪酸）。未来对这些RcYUC基因功能的研究对于进一步提高蓖麻种子和油产量至关重要。此外，RcYUC2和RcYUC4分别在雄花和雌花中高表达，这与AtYUC2在拟南芥花器官中的高表达一致；因此，这些基因也可能在蓖麻繁殖中发挥作用。
