利用反相色谱法、EAD碎片化技术和高分辨率质谱法确定脂质异构体的双键位置：在胰腺癌研究中的应用

《Analytica Chimica Acta》：Resolving lipid isomers up to the double bond position level using reversed-phase chromatography, EAD fragmentation, and high-resolution mass spectrometry: Application to pancreatic cancer

胰腺癌患者与健康人血浆脂质组学分析中，整合液相色谱（RPLC）-电子激活解离（EAD）-飞行时间质谱（TOF-MS/MS）技术，结合保留时间信息和电子解离的碎片特征，实现15类脂质（包括甘油磷脂、鞘脂和甘油三酯）的详细结构解析，发现18:1-O2/20:0鞘磷脂和16:0/18:3(n-6)磷脂等异构体的特异性差异，提升脂质组学研究灵敏度与分辨率。

　　

马琳·普林格（Marlene Pühringer）、莱奥尼达·M·兰普（Leonida M. Lamp）、德妮莎·科拉罗娃（Denisa Kolá?ová）、米兰·沃什米克（Milan Vo?mik）、丽莎·潘岑博克（Lisa Panzenboeck）、贡达·科伦斯佩格尔（Gunda K?llensperger）、米哈尔·霍尔恰佩克（Michal Hol?apek）、于尔根·哈特勒（Jürgen Hartler）、伊芙琳·兰普勒（Evelyn Rampler）

维也纳大学化学学院分析化学研究所，W?hringer Str. 38，1090 维也纳，奥地利

摘要：

背景

电子活化解离（EAD）是一种基于自由基的片段化技术，能够在单一光谱中提供关于脂质的详细结构信息，包括双键位置、sn-1/sn-2 位点的分配以及分子种类。然而，其更广泛的应用仍然受到诊断性片段强度较低的限制。另一种计算方法称为 LC=CL，它是 Lipid Data Analyzer (LDA) 软件的扩展，利用反相液相色谱（RPLC）获得的保留时间（RT）信息来识别完整脂质物种中的 ω-位置。

结果

在这里，我们提出了一种集成的 RPLC-EAD-TOF-MS/MS 工作流程，该流程结合了 LC=CL 的基于保留时间的分析和 EAD 的基于片段化的注释方法，使用 ZenoTOF 7600 进行深入的结构表征。该策略通过未标记和均匀 ¹³C 标记的酵母提取物进行了验证。通过结合保留时间识别和自由基诱导的片段化优势，我们的方法能够可靠地识别 15 种脂质类别中的双键位置和 sn-位点异构体。

意义

在分析胰腺导管腺癌（PDAC）患者和健康对照组的血浆样本时，我们展示了该策略在明确解析脂质异构体方面的能力，揭示了失调脂质的特异性结构模式。共鉴定出 15 类脂质，包括甘油脂、甘油磷脂和鞘脂。我们的发现不仅确认了已知的生物标志物，还发现了额外的链异构体（例如 SM 18:1;O2/20:0 和 SM 16:1;O2/22:0），其中只有一种表现出差异性调控。此外，我们发现了新的双键位置特异性调控现象，例如 PDAC 患者中 PC 16:0/18:3(n-6) 的差异性调控，而异构体 PC 16:0/18:3(n-3) 则没有显著变化。使用传统方法无法观察到这些现象。因此，所提出的 RPLC-EAD-TOF-MS/MS 平台有助于在生物学和临床相关样本中进行详细的结构脂质组学研究。

引言

脂质是生命的基础，为脂质双层膜内的分子相互作用提供了封闭的化学环境。¹ 除了屏障功能外，它们在信号通路中起着重要作用，并可作为癌症等疾病的生物标志物。^{2, 3}胰腺癌尤其具有挑战性，因为其生存预后较差，且缺乏可靠的早期检测标志物。⁴最近，Wolrab 等人在一项国际多实验室研究中证明，使用高分辨率质谱（MS）进行脂质组学分析可以通过膜脂质标志物（如鞘脂和神经酰胺，例如 SM 42:1;O2, SM 41:1;O2, Cer 42:1;O2）实现胰腺癌的早期检测。⁵准确监测脂质变化和疾病进展需要先进的分析工具。⁶高分辨率质谱（HRMS）已成为脂质组学的关键技术，尤其是与液相色谱（LC）或离子迁移率等分离方法结合使用时。这些方法可以提供详细的结构信息，包括脂质类别和脂肪酸组成（定义为分子脂质物种水平）。LC-MS 工作流程可以同时识别复杂生物样本中的数百到数千种脂质物种。⁷其中，反相（RP）色谱分离通常在质谱检测之前应用，因为脂质可以根据其与固定相的疏水性化学相互作用进行分离。^{8, 9}尽管在脂质组学的样本制备、分离和检测方面取得了显著进展，但在分子脂质物种水平之上获取结构细节仍然具有挑战性。例如，脂肪酸中的双键位置是一个关键的结构特征。双键会在碳氢链中引入弯曲，这显著影响脂质物种的整体结构、物理化学性质和生物活性。^{10, 11}不同的双键位置会产生具有不同化学和物理特性及生理功能的结构异构体。^{12, 13}因此，准确确定这些特征对于理解健康和疾病状态下的脂质功能至关重要。几种策略，包括 Paternò–Büchi 反应¹⁴、臭氧诱导解离（OzID）¹⁵、紫外光解离（UVPD）¹⁶和电子活化解离（EAD），可以揭示双键和 sn-位点异构体。特别是基于 EAD 的脂质组学策略，如 12 eV 下的电子撞击激发有机物离子（EIEIO），在广泛的质量范围内具有结构阐明的能力，并能解析双键位置和 sn-1/sn-2 脂酸位置。^{17, 18, 19, 20, 21, 22}虽然 UVPD 依赖于激光诱导的片段化，而 EAD 则使用低能量电子生成自由基中间体，但这两种技术都能产生 C=C 特异性的双键位置片段和其他具有结构信息的离子，通常比传统的碰撞诱导解离（CID）产生多十倍的片段信息。²³然而，UVPD 需要更长的采集时间（例如，在当前的商用 Orbitrap 系统上，如使用 213 nm 激光的 Fusion Lumos）。相比之下，基于飞行时间（TOF）的设置与 EAD 结合（例如 ZenoTOF 7600/8600, Sciex）非常适合快速 MS/MS 采集，适用于 LC-MS 工作流程。^{24, 25}尽管有这些优势，但仍存在主要挑战，如特征性片段的灵敏度较低（例如，双键定位的 V 形片段模式丰度较低）以及复杂样本的自动化脂质注释解决方案稀缺。²⁶最近，开发了一种使用反相液相色谱（RPLC）自动识别磷脂中不饱和脂肪酸 ω-位置的工作流程，该流程由工具 LC=CL 实现，它是免费开源软件 Lipid Data Analyzer (LDA) 的组成部分。²⁷在那项研究中，EAD 用于验证色谱分辨的双键位置异构体。

在这里，我们通过 LC=CL 提供的 EAD 片段化信息来补充基于 RPLC-MS/MS 的异构体注释，以确定详细的结构特征，包括双键位置分辨和 sn-位置分辨的脂质分子物种鉴定。我们使用未标记和同位素标记的酵母进行了方法验证。总体而言，RPLC-EAD-TOF-MS/MS 方法是在 ZenoTOF 7600 仪器上开发的，旨在利用保留时间和片段化的特定结构信息来分析 15 种不同脂质类别（神经酰胺（Cer）、胆固醇酯（CE）、二酰甘油（DG）、己糖基神经酰胺（HexCer）、二己糖基神经酰胺（Hex2Cer）、溶血磷脂胆碱（LPC）、溶血磷脂乙醇胺（LPE）、磷脂胆碱（PC）、磷脂乙醇胺（PE）、磷脂酰基鞘脂胆碱（PC O-）、磷脂酰基鞘脂胆碱（PC P-）、磷脂酰基乙醇胺（PE P-）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）、三酰甘油（TG））。作为概念验证，我们在胰腺癌患者和健康对照组的血浆样本分析中展示了该工作流程在明确解析脂质异构体方面的能力。

样本制备

来自赫拉德茨-克拉洛韦大学医院的 20 例胰腺导管腺癌（PDAC）患者和 20 例健康对照组的血浆样本，作为 Wolrab 等人进行的关于 PDAC 和脂质的更大规模研究的一部分。⁶脂质提取使用改良的 Folch 方法进行，具体细节在引用研究中有所描述。^{5, 28}简要来说，向 25 μl 血浆样本中加入 20 μl 内标混合物、2 ml 氯仿和 1 ml 甲醇，然后涡旋混合。

色谱条件优化

最近，使用极性封端的 C-18 反相柱实现了磷脂双键位置异构体的色谱分离。^{27, 32}我们将该方法的时间延长至 40 分钟，以覆盖更多非极性脂质类别，如二酰甘油和神经酰胺。图 1 显示了使用 RPLC 相方法的人血浆样本中主要脂质类别的洗脱谱，除了 LPC、LPE、PC O-、PC P-、PC、PE、PE P- 和 PI 类别外，现在还包括

结论

在这项工作中，我们提出了一种 40 分钟的 RPLC-EAD-TOF-MS/MS 方法，用于深入分析磷脂、神经酰胺、二酰甘油和三酰甘油，实现了双键位置异构体的基线分离。将原始的 LC=CL 库与正离子化模式 EAD 片段化以及优化的 RP 梯度相结合，实现了全面的脂质组学分析，便于在双键和 sn 位置分辨的水平上识别脂质分子物种。

CRediT 作者贡献声明

于尔根·哈特勒（Jürgen Hartler）：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件、资源、方法论、概念化。米哈尔·霍尔恰佩克（Michal Hol?apek）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源、方法论、数据管理、概念化。贡达·科伦斯佩格尔（Gunda K?llensperger）：资源、资金获取。丽莎·潘岑博克（Lisa Panzenboeck）：撰写 – 审稿与编辑、方法论。马琳·普林格（Marlene Pühringer）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件、方法论、研究、形式化。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在 MassIVE 上公开获取：https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task=d096c6ba4fbd47cea58ea82553799c6c

LDA 版本 2.11.2：https://genome.tugraz.at/lda_ead_review/lda_download.shtml

伦理声明

本研究遵循赫尔辛基宣言进行。所有志愿者均获得了知情同意，赫拉德茨-克拉洛韦大学医院的伦理委员会批准了血液样本的收集。所有收集的数据均已匿名化。

手稿准备过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用 ChatGPT（OpenAI，GPT-5 模型）协助开发 R 脚本，并结合 Grammarly 进行语言编辑。所有由 AI 辅助生成的统计脚本都经过独立审查、验证，并在必要时进行了修改。统计分析由第一作者 M.P. 执行和验证。在使用这些工具后，作者对稿件进行了严格审查和编辑，并承担全部责任。

致谢

作者感谢 Rampler 团队、科伦斯佩格尔团队（维也纳大学）、哈特勒实验室（格拉茨大学）和霍尔恰佩克实验室（帕尔杜比采大学）在分析方法、生物样本、数据分析、团队合作和跨学科科学交流方面的宝贵贡献。我们还要感谢 Isotopic Solutions 的 Gerrit Hermann 在标记和未标记 LILY 脂质提取物方面的合作。本研究得到了