用于测定适配体解离常数的光纤传感器，以及快速检测河水和牛奶中氨苄西林的方法

《Analytica Chimica Acta》：Optical-Fiber Sensors for Dissociation Constant Measurement of Aptamer and Rapid Detection of Ampicillin in River Water and Milk

针对争议性氨苄西林结合aptamer AMP17的真实性，本研究采用四类传统均相检测法均未证实其结合，转而通过光纤蒸发波传感（FOEW）测得KD分别为2.6 nM（裸光纤）和5.1 nM（BSA涂层），证实AMP17为高特异性真实aptamer，并揭示传统方法在评估SM-Apts结合常数中的局限性，提出FOEW为通用检测平台。

　　

张光新|赵海旭|李晓琪|张毅|贾海静|张桥桥|戴天宇|娄新慧

首都师范大学化学系，中国北京市西三环北路105号，邮编100048

摘要

背景

小分子结合适配体（SM-Apts）的亲和力评估结果存在冲突，这引发了人们对所报道的适配体是否真实存在的质疑。AMP17是首个被报道存在争议的适配体，它已被用于至少37种检测氨苄西林的适配体传感器中，但通过多种均相亲和力方法（包括等温滴定量热法、核磁共振光谱法和质谱法）被证明其不存在。只有原始论文使用基于亲和力柱的荧光法报告了其解离常数（K_D=13.4 nM）。AMP17真的是一种适配体吗？导致这些冲突结果的可能原因是什么？

结果

我们采用了四种最常用的均相检测方法（基于FRET的链位移检测、圆二色性检测、基于EvaGreen和Thioflavin T的无标记荧光检测以及DNase I检测），但这些方法都无法证明AMP17与氨苄西林的结合。随后，我们使用光纤衰减波传感器（FOEW）成功测得了AMP17的解离常数（K_D），在未涂覆BSA的SiO₂光纤上测得的K_D为2.6±0.2 nM，在涂覆BSA的光纤上测得的K_D为5.1±0.5 nM。通过测试其他分子并将AMP17替换为非结合序列，进一步证实了AMP17的高特异性。最后，我们构建了基于FOEW的检测系统，分别采用一步竞争性和两步非竞争性检测模式对AMP17进行检测，后者显示的检测限（LOD=2.8 fM，S/N=3）比前者低25.9倍。这两种检测模式均具有良好的抗基质干扰能力，并且能够在无需样品纯化的情况下检测到河水及牛奶中的AMP残留。

意义

我们的研究结果表明AMP17是一种具有高亲和力和特异性的真实适配体。表面固定化有利于AMP17与氨苄西林的结合。我们的研究强调了均相检测方法在评估小分子结合适配体亲和力方面的局限性。FOEW是一种适用于K_D测量和快速检测的便捷平台。

引言

适配体是单链寡核苷酸，能够以高亲和力和特异性结合多种类型的靶标。它们是通过体外方法“系统进化富集配体”（SELEX）生成的。[1],[2] 小分子结合适配体（SM-Apts）在传感器开发领域引起了广泛关注。亲和力是适配体最重要的性质之一。尽管已经有多种方法用于评估适配体的亲和力，但每种方法的适用范围尚不明确，且没有一种方法适用于所有适配体。[3]

过去十年中，小分子结合适配体的亲和力评估结果冲突的情况越来越多。一些广泛应用的适配体通过等温滴定量热法（ITC）和其他均相方法（如氨苄西林结合适配体、乙醇胺结合适配体、氯霉素结合适配体、异羧磷和磷酸酯结合适配体等）被证明其不存在。[4],[5],[6],[7],[8] 这引发了人们对每种表征技术适用范围的质疑，以及对该适配体是否真实存在的担忧。由于缺乏不同表征方法的系统比较研究，目前尚未公开每种技术的应用范围。

氨苄西林（AMP）是最常用的广谱β-内酰胺类抗生素之一，具有抑制细菌壁合成的作用。[9],[10] 然而，AMP的滥用会导致抗生素通过食物链残留在环境和食品中，这严重威胁着人类和动物的健康。因此，量化环境中和食品中的AMP残留量非常重要。AMP17（5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’）是一种广泛使用的氨苄西林结合适配体，[11] 是首个被报道存在争议的适配体。[5] 作者使用了ITC、质谱法和核磁共振光谱法（NMR）进行检测，但这三种均相方法均未能证明AMP17与氨苄西林的结合。然而，与负面结果相反，至少有37篇论文报道了基于AMP17的传感器，这些传感器采用了多种不同的传感机制（包括电化学、光电化学、电化学发光、荧光等）（表A.1）。其中30种传感器基于表面固定的AMP17。我们的团队也在2017年成功构建了一种基于AMP17的电化学传感器，将AMP17固定在电极上。[12] 到目前为止，除了原始的适配体选择论文外，尚未有其他方法测量过AMP17的解离常数（K_D）。我们还使用生物层干涉测量法（BLI）和表面等离子体共振（SPR）评估了AMP17的亲和力，但未检测到统计学上显著的信号变化（数据未展示）。负面结果可能是由于这两种方法的灵敏度有限或其他未知原因所致。此外，大多数基于AMP17的传感器使用金界面（如金纳米颗粒或金电极）（表A.1），这引发了人们对金表面可能产生假阳性效应的担忧。[4],[13],[14] 我们非常好奇AMP17是否真的是一种适配体，以及导致这些冲突结果的原因。

我们最近报道了一项针对两种17β-雌二醇结合适配体的多种表征方法的比较研究。[15] 我们的研究表明，金纳米颗粒检测、核酸酶保护检测和无标记荧光检测均无法证明这两种适配体的亲和力。进一步的研究表明，光纤衰减波传感器（FOEW）[16] 能够证明它们对17β-雌二醇的高亲和力，并实现了超灵敏和特异性的检测，但目前尚未能够测量解离常数（K_D）。FOEW主要基于近场荧光激发原理，利用激光在光纤内的全反射效应工作。由于其低成本、简单设计、高灵敏度和易于与其他传感技术集成等优点，FOEW传感器已成为快速检测多种靶标的通用平台。[17]

在本研究中，我们使用了四种均相检测方法（基于荧光共振能量转移（FRET）的链位移检测、圆二色性（CD）、基于EvaGreen和Thioflavin T（ThT）的无标记荧光检测以及DNase I检测）全面评估了AMP17的亲和力。所有检测方法均未检测到AMP17与氨苄西林的结合。为避免金表面的潜在假阳性效应，我们使用涂有不同涂层（SiO₂）的光纤安装的FOEW测量了AMP17的解离常数（K_D），得到的K_D值较低，略低于原始选择论文中报告的值。通过检测靶标和阴性对照序列，也证实了AMP17的高特异性。使用两种不同的检测模式均实现了对AMP的灵敏和特异性检测。我们的数据支持AMP17是一种真实的适配体。四种无需固定化的检测方法的阴性结果进一步说明了每种表征方法的局限性，表明FOEW可以作为一种通用的平台，用于评估SM-Apts的亲和力并快速检测小分子。

材料与仪器

本研究使用的DNA探针（表A.2）、试剂和仪器的详细信息见支持文件。

基于FRET的链位移检测

将50 nM的AMP17-FAM和250 nM的D-cAMP17混合在1×结合缓冲液（20 mM Tris、50 mM NaCl、5 mM KCl、5 mM MgCl₂，pH 8.0）中，于25°C下孵育30分钟，然后加入200 μM的AMP并继续孵育30分钟，之后进行荧光测量。优化了温度、离子强度、cDNA浓度以及AMP和cDNA的顺序以获得最佳检测条件。

基于FRET的链位移检测未能证明AMP17的亲和力

基于FRET的链位移检测基于目标结合诱导的链位移原理（图1A）。具体而言，AMP17用FAM标记，而互补或部分互补的DNA（cDNA）链用荧光淬灭剂标记。当AMP17与cDNA杂交时，由于FRET作用荧光被淬灭；AMP与AMP17的结合会导致cDNA解离，从而恢复荧光。

我们首先采用了最常用的“5+7”探针设计进行FRET-链位移检测。

结论

小分子结合适配体（SM-Apts）的亲和力表征具有挑战性，这一点从不同表征方法对同一适配体得出矛盾的结果中可见一斑。以AMP17为例，我们使用了四种均相表征方法（基于FRET的链位移检测、圆二色性（CD）、基于EvaGreen和ThT的无标记荧光检测以及DNase I检测）对其亲和力进行了评估，但所有方法均未能证实AMP17与氨苄西林的结合。因此，我们进行了进一步的研究。

CRediT作者贡献声明

李晓琪：研究工作。张毅：研究工作。张光新：撰写初稿、研究工作。赵海旭：研究工作。张桥桥：研究工作。戴天宇：研究工作。贾海静：研究工作。娄新慧：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学设计、资金申请、概念构思

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金 [资助编号 22374104]的支持。