《Bioresource Technology》：Enhanced rhamnolipid production in
Pseudomonas putida through systematic medium optimization and metabolic engineering
编辑推荐：
本研究通过响应面法优化培养基（葡萄糖与甘油混合碳源，硝酸盐氮源）及代谢工程过表达rmlBDAC（产糖）和accA/fabD（产脂）基因，显著提升产碱菌 KT2440 的拉曼脂质产量，摇瓶达9.8 g/L，生物反应器达40.2 g/L，为工业化生产奠定基础。
庞爱萍|张腾|杨坤|王霞|黄亮刚|张波|刘志强|郑玉国
中国浙江省工业大学手性化学品生物制造国家与地方联合工程研究中心，杭州310014，中国
摘要
鼠李糖脂是一种具有广泛工业应用的生物表面活性剂，但其生产仍受到低产量和高成本的限制。本研究通过系统的培养基优化和代谢工程改造了非致病性菌株P. putida KT2440，以提高其鼠李糖脂的产量。利用响应面分析法，我们开发出一种最佳培养基配方，该配方采用混合碳源（葡萄糖和甘油）和氮源（酵母提取物和NaNO3）。优化后的培养基使鼠李糖脂的产量从Luria-Bertani培养基中的1.5?g/L（含1%葡萄糖）提高到摇瓶培养中的6.1?g/L，提高了306.7%。转录分析显示，培养基优化增强了Entner-Doudoroff途径的通量，降低了胞质外途径的通量，并改善了营养物质的吸收，而鼠李糖脂合成途径本身并未显著上调。为了解决这一瓶颈，我们应用代谢工程来增加鼠李糖脂前体的供应。通过过表达参与鼠李糖（rmlBDAC）和脂肪酸（accA, accD, fabD）合成的基因，工程菌株accAD-fabD-R在摇瓶培养中的鼠李糖脂产量达到了9.8?g/L，在5?L生物反应器中的产量达到了40.2?g/L，生产率为0.56?g/L/h，这是迄今为止报道的P. putida工程菌株中的最高水平。本研究展示了一种在P. putida中高效生产鼠李糖脂的有效策略，凸显了其在工业规模生物制造中的潜力。
引言
鼠李糖脂是由微生物产生的两亲性生物表面活性剂，其特征是亲水性的鼠李糖头部和疏水性的脂肪酸尾部（Guzmán等人，2024年；Kumar等人，2023年；Lavanya，2024年；Thakur等人，2024年）。这种独特的结构赋予了它们显著的表面活性，能够有效降低表面和界面张力（Wongsirichot和Winterburn，2025年）。除了传统的表面活性剂特性（如润湿、起泡和乳化作用）外，鼠李糖脂还表现出优异的生物降解性、低毒性、更高的选择性和特异性、对温度、pH值和盐度的耐受性以及抗菌活性，这些特性使其适用于多种潜在应用（Moutinho等人，2021年；Wongsirichot和Winterburn，2025年）。这些应用领域包括提高石油回收率、化妆品、清洁、农业和生物修复以及生物医学领域。尽管商业化仍处于初级阶段，但Evonik公司在斯洛伐克开设了首座商业鼠李糖脂生产工厂，标志着向大规模生产迈出了有希望的一步（Kashif等人，2022年；Yan等人，2012年；Zeng等人，2018年）。然而，由于产量低和原料成本高，目前的生产成本仍远高于传统石化表面活性剂（Miao等人，2024年；Moutinho等人，2021年），因此仍存在挑战。通过优化培养基、菌株代谢工程和发酵设计来应对这些挑战对于提高鼠李糖脂的生产至关重要，从而增强其技术和经济可行性及市场竞争力。
培养基的配制和优化对微生物生长和产品合成至关重要（Singh等人，2017年）。特别是碳源对鼠李糖脂的产量有显著影响。在鼠李糖脂的生产中，既使用了亲水性碳源也使用了疏水性碳源，其中疏水性碳源（如植物油）被证明特别有效（Abdel-Mawgoud等人，2011年）。Dina等人（2024年）评估了多种脂质碳源，包括葵花籽油、石蜡、转基因大豆油和黑种草油，发现葵花籽油和大豆油的混合物是最优选择，因为其临界胶束浓度最低（31.5 mN/m）（Diba等人，2024年）。在亲水性碳源中，甘油和葡萄糖是常见的选择。Sankhyan等人（2024年）证明，1%的葡萄糖和粗甘油组合显著提高了P. aeruginosa的鼠李糖脂产量，达到了2.5?g/L，而单独使用葡萄糖或粗甘油时分别为1.36?g/L和1.12?g/L（Sankhyan等人，2024年）。在P. putida KT2440中也观察到了类似的结果，1%的葡萄糖和甘油组合使鼠李糖脂产量提高了2.67?g/L（Pang等人，2024年）。相比之下，氮源对鼠李糖脂产量的影响似乎小于碳源，可能是因为氮源不直接参与这一过程（Wongsirichot和Winterburn，2025年）。硝酸盐已被确定为诱导P. aeruginosa产生鼠李糖脂的最佳氮源（Abdel-Mawgoud等人，2011年）。其他培养基成分如磷酸盐和金属离子也对鼠李糖脂的合成很重要（Abalos等人，2002年）。然而，大多数关于培养基优化的研究集中在P. aeruginosa上，针对P. putida的研究较少。因此，优化P. putida的培养基对于提高鼠李糖脂产量至关重要。
除了培养基优化外，还采用了代谢工程策略来增强鼠李糖脂的产量。通过替换关键基因rhlAB的启动子来调节其表达水平对于提高鼠李糖脂产量至关重要。Tiso等人构建了一个合成启动子库来驱动rhlAB的表达，并确定了最佳菌株pSynPro8，该菌株的鼠李糖脂产量显著提高到了2.8?g/L（Tiso等人，2016年）。Feng等人用强启动子PoprL替换了rhlAB的原始启动子，基因工程菌株WJPAB的鼠李糖脂产量达到了57.83?g/L，比野生菌株WJ高出91.17%（Feng等人，2023年）。消除竞争性代谢途径（包括胞外多糖、聚羟基烷酸和鞭毛操纵子的途径）显著提高了鼠李糖脂的产量。例如，在P. aeruginosa中，pslAB和phaC1DC2的双突变使鼠李糖脂产量提高了69.7%，而在P. putida中敲除鞭毛操纵子后，72小时内的产量提高到了1.65?g/L（Lei等人，2020年；Pang等人，2024年）。此外，在Escherichia coli中，共表达与鼠李糖脂前体相关的基因rfbD和fabG使鼠李糖脂产量显著提高了44%（Du等人，2017年）。在我们之前的研究中，我们成功改造了一种P. putida菌株，在5?L生物反应器中的鼠李糖脂产量达到了28.6?g/L，这是迄今为止报道的工程P. putida的最高产量（Pang等人，2025年）。这是通过合理设计RhlA、增强rhlAB的表达以及改善糖前体dTDP-l-鼠李糖的供应实现的。然而，这一产量仍远低于工业规模生产所需的水平。
在本研究中，我们采用了一种系统的方法，结合培养基优化和定向代谢工程来提高P. putida中的鼠李糖脂产量。首先使用响应面分析法（RSM）优化了培养基，使用我们之前改造的P. putida AB-Δflag菌株，显著提高了鼠李糖脂的合成效率。随后进行了转录组分析，以阐明产量提高的机制并识别剩余的代谢瓶颈。基于这些发现，实施了代谢工程策略来增加脂肪酸和鼠李糖前体的供应。最终得到的菌株accAD-fabD-R在鼠李糖脂产量上取得了显著提升，证明了P. putida作为工业规模生物表面活性剂生产平台的潜力。
菌株和质粒
本研究中使用的所有菌株和质粒的详细信息列在补充表S1和S2中。P. putida Δflag菌株保存在我们的实验室中（Pang等人，2024年），用作鼠李糖脂合成的宿主。E. coli DH5α菌株被用作质粒构建的克隆宿主。之前在我们实验室构建和维护的质粒pBBR1MCS5和pMEKa被用于基因过表达。
使用RSM进行培养基优化
通过RSM优化了发酵培养基。首先，
系统性的培养基优化显著增强了鼠李糖脂的生物合成
我们使用之前改造的P. putida AB-Δflag菌株系统地优化了发酵培养基。该菌株是P. putida KT2440的衍生物，表达了异源基因rhlAB，并删除了鞭毛基因簇（Pang等人，2024年）。最初，通过单因素测试评估了不同类型和浓度的碳源、氮源、磷酸盐和金属离子对鼠李糖脂产量的影响。
结论
本研究提出了一种综合策略，结合培养基优化、转录分析和代谢工程，显著提高了P. putida中的鼠李糖脂产量。工程菌株accAD-fabD-R过表达了参与鼠李糖（rmlBDAC）和脂肪酸（accA, accD, fabD）合成的关键基因，在优化后的RSM培养基中，摇瓶培养的鼠李糖脂产量达到了9.8?g/L。在5?L发酵罐中的补料分批培养进一步提高了产量。
CRediT作者贡献声明
庞爱萍：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学。张腾：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究。杨坤：数据分析，概念化。王霞：数据管理。黄亮刚：软件支持。张波：验证。刘志强：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调。郑玉国：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2022YFA0911800）、浙江省自然科学基金（LTGS24C010002）和国家自然科学基金（32200037）以及中国石油 Corporation 的科学技术项目（2025DQ0733）的资助。
