在Au@CeO?-x/Bi?MoO?平台上实现的双循环信号放大技术：朝着临床诊断中用于检测CA125的超灵敏且无需酶的夹心免疫传感器迈进

《Biosensors and Bioelectronics》：Dual-Cycle Signal Amplification on an Au@CeO 2-x/Bi 2MoO 6 Platform: Toward an Ultrasensitive and Enzyme-Free Sandwich Immunosensor for CA125 in Clinical Diagnostics

本工作设计了一种双循环信号放大的电化学免疫传感器用于高灵敏度检测卵巢癌标志物CA125。通过Au@GO-Chi-Fc纳米复合材料固定抗体，利用Ce掺杂Bi2MoO6纳米花催化无酶信号放大，实现超宽线性范围（0.0005–100 U mL?1）和超低检测限（0.00049 U mL?1），并保持18天的高稳定性和选择性。

　　

杨敏杰|冯美娜|查玲|刘曦|马元辉|黄颖|欧阳瑞卓|孙东|苗玉清|刘宝林

上海科技大学铋与铼科学研究所，中国上海200093

摘要

卵巢癌生物标志物的早期检测对于有效诊断至关重要，这需要高度敏感和可靠的免疫传感平台。在这项工作中，我们开发了一种双循环放大夹心型电化学免疫传感器，用于检测碳水化合物抗原125（CA125），这是卵巢癌的关键生物标志物。该传感平台通过将一级抗体（Ab1）固定在经过Au@GO-Chi-Fc纳米复合材料改性的玻璃碳电极上来构建。二级抗体（Ab2）与锚定在Ce掺杂的Bi₂MoO₆纳米花上的金纳米颗粒（Au@CeO_2-x/Bi₂MoO₆）结合，制备出催化探针。这些探针能够高效催化对硝基苯酚（p-NP）还原为对氨基苯酚（p-AP），随后与NaBH₄发生电催化化学（ECC）氧化还原循环反应，从而实现显著的信号放大。这种无酶策略使免疫传感器具有超宽的线性范围（0.0005–100 U mL^-1）和超低的检测限（0.00049 U mL^-1），能够准确量化不同人血清样本中的CA125。此外，该免疫传感器表现出高选择性、优异的重现性和18天内的稳定性能，凸显了其在复杂生物基质中检测微量CA125的稳健性和临床潜力。

引言

卵巢癌是一种高度致命的妇科恶性肿瘤，由于症状不典型且缺乏有效的早期诊断工具，通常在晚期才被发现（Charkhchi等人，2020年）。五年生存率清楚地反映了这一挑战：早期（I/II期）疾病的生存率超过90%，而晚期（III/IV期）病例的生存率则降至20–40%，这突显了早期检测对改善患者预后的重要性（F和I，2014年；Schiavone等人，2011年）。 碳水化合物抗原125（CA125）是一种高分子量糖蛋白，是用于诊断卵巢癌、监测治疗反应和监测复发的主要血清生物标志物（Charkhchi等人，2020年）。即使是在缓解期的患者中，CA125的轻微、低于阈值的升高也与复发风险增加相关，这突显了需要超灵敏和可靠的检测平台（Antonio等人，2005年；L等人，2003年；Rustin等人，1996年；Salani等人，2011年；Wang等人，2023年）。传统的检测方法，如电化学发光和酶联免疫吸附测定（ELISAs），受到线性范围狭窄、相对较低的灵敏度以及依赖酶的系统的不稳定性的限制。虽然像近红外ECL免疫传感器这样的先进平台提供了更高的灵敏度，但它们往往面临重现性和临床实用性方面的挑战（Yin等人，2021年）。 电化学免疫传感器结合了抗原-抗体相互作用的高特异性与电化学传感器的灵敏度和便携性，已成为生物标志物检测的强大工具（Science等人，2018年）。大量研究致力于通过纳米材料工程和创新信号放大策略来提升其性能（Ouyang等人，2025a；RuizhuoOuyang等人，2024年；Wang等人，2024年）。例如，虽然使用聚合物修饰电极的无标记传感器简单易用，但它们通常缺乏可靠的早期检测所需的信号放大能力（Castro等人，2020年）。无酶放大策略，如Dutta等人报道的电催化化学（ECC）氧化还原循环系统，提供了比基于酶的方法更高的灵敏度和更好的稳定性（Gorachand和B，2017年）。然而，实现超高的灵敏度通常需要复杂的纳米材料合成或多步骤级联放大，这可能会影响重现性和可扩展性，并阻碍临床应用（Guangxin等人，2024年；H等人，2021年；T等人，2021年）。因此，迫切需要一种既能简化制备过程又能具备强大多方面放大机制的传感器设计，以实现超低检测限而不牺牲实际应用性。 为了解决这些挑战，我们开发了一种新型夹心型电化学免疫传感器，采用双循环信号放大策略来实现CA125的超灵敏检测。传感器结构如图1所示。一个关键创新是多功能电极基底的合成。这种材料，称为Au@GO-Chi-Fc，结合了氧化石墨烯（GO）的大表面积和导电性、壳聚糖（Chi）的优异成膜能力、二茂铁（Fc）的出色电活性以及金纳米颗粒（Au NPs）的生物相容性。这种复合材料促进了高效的一级抗体（Ab1）固定，并增强了电子转移动力学（Li等人，2025年；Song等人，2025年）。 为了信号放大，我们设计了Ce掺杂的Bi₂MoO₆纳米花作为Au NPs和二级抗体（Ab2）的载体。这种复合材料Au@CeO₁.₆₆/Bi₂MoO₆作为高效的纳米酶，催化对硝基苯酚（p-NP）还原为对氨基苯酚（p-AP）。生成的p-AP随后与NaBH₄发生ECC氧化还原循环。在这个循环中，p-AP在电极表面被电氧化为对醌亚胺（p-QI），并通过NaBH₄的化学还原不断再生为p-AP。这种自维持循环显著放大了电化学信号（Gorachand和B，2017年）。 这项工作通过以下方面取得了关键进展：（1）多功能Au@GO-Chi-Fc纳米复合材料，作为先进的基底，增强了抗体负载和电子转移，克服了传统材料的局限性；（2）无酶的Au@CeO₁.₆₆/Bi₂MoO₆催化标签，实现了高效的p-NP还原，消除了与生物酶相关的不稳定性和成本问题；（3）将纳米催化剂介导的还原循环与化学辅助的ECC氧化还原系统相结合，建立了双放大途径，实现了超越单一放大方法的卓越灵敏度。这些贡献共同造就了一种具有顶级分析性能的免疫传感器，包括超低检测限、宽线性范围、高选择性和优异的稳定性。该传感器在人血清样本中准确检测CA125的能力凸显了其在卵巢癌早期筛查和监测中的潜力。

材料与设备

本研究中使用的所有材料和仪器的详细描述见补充材料。

Au NPs的制备

Au NPs是通过改进的柠檬酸还原方法合成的（Thanh等人，2018年）。简要来说，将10 mL去离子水置于烧杯中并持续搅拌。然后加入300 μL 10 mM HAuCl₄，接着加入300 μL 100 mM三钠柠檬酸。搅拌10分钟后，加入150 μL 100 mM NaBH₄，溶液立即变为橙红色。

Au@GO-Chi-Fc的表征

功能性纳米材料的合理设计和可控合成是构建传感平台的基础步骤。如图2a所示，TEM分析揭示了Au@GO-Chi-Fc纳米复合材料的层次结构。GO特有的褶皱薄膜形态为后续的功能化提供了广阔的高表面积基底。值得注意的是，Chi-Fc组分均匀沉积在GO片上，表现出更粗糙的表面

结论

本研究提出了一种用于超灵敏检测CA125的夹心型电化学免疫传感器，采用基于合理设计的纳米复合材料的双循环信号放大策略。Au@GO-Chi-Fc基底促进了高效的抗体固定和界面电子转移，而Au@CeO₁.₆₆/Bi₂MoO₆催化探针实现了无酶放大，通过p-NP的还原和随后的NaBH₄驱动的ECC氧化还原循环。该免疫传感器

CRediT作者贡献声明

马元辉：软件、形式分析。 黄颖：方法学。 查玲：验证、方法学。 刘曦：软件。 杨敏杰：写作——审稿与编辑、写作——初稿、形式分析、数据管理、概念化。 冯美娜：研究、资金获取。 刘宝林：概念化。 孙东：监督、资金获取。 苗玉清：概念化。 欧阳瑞卓：资源、项目管理、资金获取。

未引用的参考文献

Castro等人，2014年；F和I，2014年；Gorachand和B，2017年；H等人，2021年；L等人，2003年；Science，C.o.E.，工程，H.U.，中国长沙410082；生物学，K.L.o.E.，污染控制，H.U.，教育部，中国长沙410082，2018年；T等人，2021年。

利益冲突

不存在需要声明的利益冲突。

利益冲突声明

本研究中不存在需要声明的利益冲突。

致谢

本工作得到了中国五矿集团科技项目（2022ZXA02）、河南师范大学化学与化学工程学院的开放研究基金（2024Y12）、河南师范大学肿瘤能量治疗协作创新中心、河南师范大学技术创新团队（2022TD03）以及河南省基础研究专项（23ZX009）的财政支持。作者对此表示衷心感谢。