串联侵入式信号放大技术用于基于荧光偏振的末端转移酶活性检测

《BioChip Journal》：Tandem Invasive Signal Amplification for Sensitive, Fluorescence Polarization-Based Terminal Transferase Activity Assay

终端转移酶（TdT）活性检测新方法TELLER基于荧光偏振（FP）技术，通过目标触发的多聚胸腺嘧啶序列延伸，结合FEN1酶的循环切割反应释放单核苷酸荧光探针，实现高灵敏度检测（0.17 U/mL）和快速分析（50分钟）。方法简化了信号材料制备，采用淬灭剂-free探针和比色法读数，有效规避环境干扰，并在血浆、尿液样本中验证了高精度和重复性。分隔符：

　　

摘要

末端转移酶（TdT）被认为是诊断和预测白血病的一个有前景的生物标志物。以往的荧光检测方法显示出一定的敏感性。然而，这些方法在工作流程中存在一些问题，包括信号材料的制备、检测时间以及成本。此外，荧光读数过程中还会受到外部干扰（如环境光、电子设备、振动等）的影响，这阻碍了信号的稳定检测。为了克服这些缺点，我们提出了一种简单且灵敏的TdT活性检测方法，称为“TELLER”（TdT ELongation-LEd串联入侵信号放大R反应），该方法基于荧光极化（FP）信号传导机制。在TELLER中，目标序列的延伸会引发强烈的信号放大反应，形成与检测探针（杠杆探针和报告探针（RP））相连的串联重复结构。Flap内切酶I（FEN1）对这种连接结构具有特异性和高周转率的切割活性，能够对RP进行循环切割反应，释放出大量带有单个核苷酸的荧光团（Fs）。这一过程导致荧光团的分子量显著降低，从而加快其翻滚速度，进而引起FP信号的巨大变化。该检测方法能够在50分钟内检测到低至0.17 U/mL的TdT活性。此外，TELLER在生物样本（血浆和尿液）中成功通过了TdT活性恢复测试，证明了其实际应用的可行性和高精度及重复性。FP信号传导机制还具有其他优势：它使用无需淬灭剂的报告探针，使得信号材料的制备简单且成本低廉；其检测结果具有比率特性，因此对环境干扰具有天然的耐受性。因此，该方法能够高效地捕捉到微量的目标信号，具有很高的灵敏度。总体而言，TELLER的概念可以进一步应用于开发其他具有序列延伸功能的酶的生物传感器，或者那些利用TdT作为信号放大媒介的酶的生物传感器。

末端转移酶（TdT）已被视为诊断和预测白血病的一个有前景的生物标志物。以往的荧光检测方法显示出一定的敏感性。然而，这些方法在工作流程中存在一些问题，包括信号材料的制备、检测时间以及成本。此外，荧光读数过程中还会受到外部干扰（如环境光、电子设备、振动等）的影响，这阻碍了信号的稳定检测。为了克服这些缺点，我们提出了一种简单且灵敏的TdT活性检测方法，称为“TELLER”（TdT ELongation-LEd串联入侵信号放大R反应），该方法基于荧光极化（FP）信号传导机制。在TELLER中，目标序列的延伸会引发强烈的信号放大反应，形成与检测探针（杠杆探针和报告探针（RP））相连的串联重复结构。Flap内切酶I（FEN1）对这种连接结构具有特异性和高周转率的切割活性，能够对RP进行循环切割反应，释放出大量带有单个核苷酸的荧光团（Fs）。这一过程导致荧光团的分子量显著降低，从而加快其翻滚速度，进而引起FP信号的巨大变化。该检测方法能够在50分钟内检测到低至0.17 U/mL的TdT活性。此外，TELLER在生物样本（血浆和尿液）中成功通过了TdT活性恢复测试，证明了其实际应用的可行性和高精度及重复性。FP信号传导机制还具有其他优势：它使用无需淬灭剂的报告探针，使得信号材料的制备简单且成本低廉；其检测结果具有比率特性，因此对环境干扰具有天然的耐受性。因此，该方法能够高效地捕捉到微量的目标信号，具有很高的灵敏度。总体而言，TELLER的概念可以进一步应用于开发其他具有序列延伸功能的酶的生物传感器，或者那些利用TdT作为信号放大媒介的酶的生物传感器。