《PLOS Computational Biology》：A comparative study of statistical methods for identifying differentially expressed genes in spatial transcriptomics
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本研究系统比较了空间转录组学（ST）中差异表达（DE）基因识别的统计方法，发现常用Wilcoxon秩和检验因忽略空间相关性导致假阳性率膨胀。研究提出基于广义估计方程（GEE）的独立GEE检验，通过模拟和真实数据（乳腺癌/前列腺癌ST数据集）验证其具有最优的I型错误控制能力与可比检验效能。成果以R包"SpatialGEE"实现，为ST数据分析提供稳健新工具。
空间转录组学技术背景与挑战
空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）技术在保留组织空间位置信息的同时实现全基因组表达谱检测，为癌症等复杂组织架构研究提供新视角。差异表达基因识别是ST分析的核心目标之一，但当前主流工具Seurat默认采用的Wilcoxon秩和检验因忽略空间相关性，可能导致假阳性率失控。
统计方法比较框架
研究系统评估了五种统计方法：Wilcoxon秩和检验、两样本z检验、广义估计方程（GEE）稳健Wald检验、GEE广义得分检验（GST）以及独立GEE检验。通过模拟研究设置三种空间相关性强弱场景（弱/中/强），采用GLMM模型参数估计结果生成零膨胀计数数据，以I型错误控制和检验效能为核心指标。
模拟研究结果
在I型错误控制方面，独立GEE在所有空间场景下均保持稳定，而Wilcoxon检验在强相关性下出现假阳性膨胀，z检验在中强相关性下严重失控。GEE-GST在聚类数m=25时检验效能偏低，但m=100时与其他方法相当。独立GEE因将每个斑点作为独立聚类并使用稳健标准误校正，展现出最优误差控制能力。
真实数据验证
在乳腺癌和前列腺癌10× Genomics Visium数据集应用中，Wilcoxon检验的QQ图偏离基准线最显著，尤其在零占比低于50%的基因中假阳性风险更高。通过组织内部对照实验（纤维组织分区比较），独立GEE与GEE-GST的p值分布更接近理论分布。通路富集分析显示，独立GEE能识别更多癌症相关通路（如PI3K-Akt信号、黏着斑通路），而GEE-GST结果相对保守。
计算效率比较
非参数检验（Wilcoxon、z检验）计算最快（4-15秒），独立GEE次之（9-45秒），GEE-GST因需估计空间协参数最耗时（170-220秒）。GLMM因43%基因无法收敛被排除比较，凸显其处理零膨胀数据的局限性。
结论与展望
独立GEE通过"工作独立"假设与稳健标准误校正，在控制I型错误与计算效率间取得平衡，建议作为Wilcoxon检验的补充方案。研究开发的R包SpatialGEE为ST数据分析提供新工具，未来需在不同ST技术平台（如Xenium、Slide-Seq）中验证方法普适性。
