整合多组学与生化研究方法，探讨氨诱导的氧化应激、代谢紊乱以及罗森伯格大虾（Macrobrachium rosenbergii）鳃部的细胞凋亡现象

《Fish & Shellfish Immunology》：Integrated multi-omics and biochemical insights into ammonia-induced oxidative stress, metabolic disruption, and apoptosis in Macrobrachium rosenbergii gills

氨氮污染对罗氏沼虾鳃的多组学影响及生物标志物筛选。通过形态学、生化、转录组和代谢组学分析，发现50 mg/L氨氮导致鳃上皮损伤、氧化应激加剧，并激活凋亡和免疫通路，鉴定出7个关键生物标志物。摘要结束。

　　

Nusrat Liaqat|Xuenan Li|Huici Yang|Sayed M. Aboleila|Kiran Shahzadi|Nauman Khan|Nader N. Hassona|Xilin Dai

中国农业部淡水水生遗传资源重点实验室，上海海洋大学，上海201306

摘要

氨氮（NH₃–N）污染仍然是威胁现代水产养殖系统健康和生产力最普遍的压力源之一。然而，其对甲壳类动物生理的多层次影响尚未完全了解。本研究阐明了Macrobrachium rosenbergii鳃在亚致死浓度氨氮（0、2和50 mg L^-1）作用下七天内的形态学、生化、转录组学和代谢组学反应。组织学观察显示，鳃逐渐恶化，表现为上皮细胞脱落、层状结构融合和血细胞浸润。抗氧化酶活性（SOD和CAT）在轻度胁迫下有所增强，但在严重胁迫下显著降低，表明存在氧化功能障碍。转录组分析发现2 mg L^-1和50 mg L^-1组分别有2,207个和1,579个基因上调，2,552个和2,191个基因下调（FDR < 0.05）。差异表达基因主要涉及氧化应激、氮代谢、细胞凋亡和免疫信号通路。代谢组分析进一步显示瓜氨酸和柠檬酸水平升高，反映了尿素循环和能量代谢的紊乱。综合多组学分析表明，瓜氨酸、柠檬酸、GLUD1、NOS1、BCL2L1、MDA和GSH是早期检测氨胁迫的可靠生物标志物。这些发现共同构成了一个全面的机制框架，有助于理解氨对甲壳类动物的毒性作用，并为可持续水产养殖管理中的健康监测提供了分子指标。

引言

巨型淡水虾（Macrobrachium rosenbergii）是全球淡水养殖中的关键物种，因其生长迅速、适应性强和经济效益高而受到重视[1]、[2]。据估计，该物种的全球年养殖产量超过30万吨，产值超过24亿美元[3]。随着水产养殖规模的扩大以满足日益增长的食物需求，集约化养殖方式对水生环境造成了越来越大的破坏。其中最紧迫的挑战之一是氮废物（尤其是氨氮（NH₄⁺/NH₃）的积累，这对水质和虾的健康构成了严重威胁[4]。集约化养殖的特点是高密度养殖、大量饲料投入以及未食用饲料和粪便的积累，导致大量氮废物的产生。当这些废物被矿化时，会生成氨氮（NH₄⁺/NH₃），如果生物过滤和水分交换不足，这些氨氮会积累。这种来自养殖场的氨氮成为水质和虾健康的主要决定因素[5]。然而，当氨在养殖水中积累时，其非离子形式（NH₃）可以自由穿过鳃上皮细胞，扰乱细胞内pH平衡，损害线粒体能量产生，并引发氧化应激[6–8]。在高浓度下，尤其是非离子形式的氨（NH₃），容易穿过鳃上皮细胞，破坏细胞内pH平衡，影响ATP的产生并引发氧化应激[1]、[9]。长期暴露于这种条件下会导致水产养殖系统的生理功能障碍和显著死亡率[10]。

在甲壳类动物中，鳃不仅仅是呼吸器官；它们还是负责呼吸、渗透调节、酸碱平衡和氮排泄的多功能界面。由于鳃是气体交换、离子平衡和氨排泄的主要场所，因此它们会对水质恶化迅速作出反应，从而在胁迫下表现出早期病理变化[11]。当暴露于高浓度氨时，甲壳类动物的鳃常出现结构损伤，包括上皮细胞脱落、层状结构融合和血细胞浸润[12]、[13]、[14]。这些形态变化通常伴随着与离子转运、氧化还原平衡和免疫调节相关的基因表达和酶活性的变化[15]。然而，先前的研究表明，参与膜脂质重塑、抗氧化防御和免疫保护的基因上调是对氨胁迫的补偿性反应[16]、[17]。然而，M. rosenbergii中这些适应性反应的具体分子和代谢机制仍不十分清楚[18]、[19]。

多组学技术（包括转录组学、组织病理学和代谢组学）的最新进展大大增强了我们解析甲壳类动物对氨氮等环境压力源反应的复杂生物网络的能力[19]、[20]。这些研究表明，氨暴露可以重新编程细胞代谢，改变解毒和抗氧化酶活性，并破坏M. rosenbergii鳃的能量稳态[4]。此外，鳃组织的代谢组分析显示氨基酸和能量代谢的变化，反映了氨解毒和组织修复的潜在补偿机制[19]、[21]。尽管这些研究提供了重要见解，但它们主要集中在其他甲壳类物种或单个组学层面，而对M. rosenbergii鳃在亚致死氨暴露下的全面、综合评估仍不足。多组学框架能够同时关联分子调控、代谢重塑和组织病理，提供比任何单一方法更完整的生物学图景。

本研究采用综合多组学方法，研究了M. rosenbergii鳃在七天内对亚致死浓度氨氮（2和50 mg L^-1）的反应。通过结合组织学分析、氧化应激和抗氧化生物标志物检测、RNA-Seq转录组学以及非靶向代谢组学，本研究旨在揭示胁迫适应的协调结构、生化和分子途径。通过这种综合方法，我们旨在阐明氨诱导胁迫的多个生物学层面的机制，并确定早期检测的潜在生物标志物，从而为提高甲壳类水产养殖的韧性和可持续性提供策略指导。

实验动物和适应

从中国上海金山的一家商业孵化场获得了M. rosenbergii幼虾（平均体重：10.01 ± 0.35克）。所有虾都经过目视检查，确保其健康且无明显疾病或损伤。共108只虾在充气条件下被运输到实验室，并在90升的玻璃纤维池中适应7天（每个池12只虾）。水质参数保持在27 ± 1°C、pH 7.8–8.0、溶解氧5.0–6.0

测序和映射效率

所有组（GC、G2和G50）的测序质量和映射效率均较高。每个文库产生了3980万至4950万条高质量读段，Q20值超过98%，Q30值超过95%。GC含量分别为GC组39.3–41.6%、G2组41.0–42.0%、G50组38.4–41.7%。总映射率为91.4–94.4%，61.6–79.7%的读段与参考基因组唯一对齐，证实了数据集适用于后续分析（表2）。

存活率

对照组（0

讨论

水质对水产养殖物种的健康和生产力起着关键作用。氨氮是水产养殖环境中最持久的毒性物质之一，长期暴露会严重损害甲壳类动物的生理功能。作为气体交换、渗透调节和氨排泄的主要器官，鳃对水中氨氮的变化非常敏感[51]、[52]。本研究首次进行了广泛的氨毒性多组学评估

结论

本研究首次提供了关于M. rosenbergii鳃中氨氮毒性的综合多组学见解。氨暴露破坏了鳃结构，削弱了抗氧化防御能力，并抑制了线粒体代谢，导致氧化应激和细胞凋亡。IDH3、DLAT和SDHA的表达下调，而CASP3、BCL2L1、GLUD1、NOS1和CA4的表达上调，表明氨引发了氧化还原崩溃和代谢途径的重定向。瓜氨酸的积累

未引用的参考文献

[6]、[7]、[8]。

作者贡献

Nusrat Liaqat：概念提出、正式分析、初稿撰写、可视化、审稿与编辑。Xuenan Li：数据整理、审稿与编辑。Huici Yang：数据整理、审稿与编辑。Nauman Khan：数据整理、撰写、审稿与编辑。Sayed M. Aboleila：数据整理、撰写、审稿与编辑。Kiran Shahzadi：数据整理、撰写、审稿与编辑。Nader N. Hassona：数据整理。Xilin Dai：概念提出、项目管理和资金支持

伦理声明

所有动物实验均遵循《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了上海海洋大学动物伦理委员会的批准（批准编号SHOU-DW-2022-051）。所有实验方案均符合ARRIVE指南（https://arriveguidelines.org）。

数据可用性

本研究生成的原始RNA-seq数据已存入NCBI序列读取档案（SRA），BioProject编号为PRJNA1346940。可通过以下链接访问数据集：

https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1346940?reviewer=8ode1ca3893ga11a3uuddluhbd

资金支持

本研究得到了中国上海农业应用技术发展计划（项目编号G2021-02-08-00-12-F00748）的支持。此外，本研究还得到了上海农业科技创新项目“耐氨氮、快速生长的Macrobrachium rosenbergii分子育种关键技术”（项目编号2025-02-08-00-12-F00056）的支持。