基于核磁共振与液相色谱-质谱联用技术的IgG1抗体Fc区甲硫氨酸氧化立体化学与结构表征研究

《Analytical Chemistry》：Stereochemical and Structural Characterization of Methionine Oxidation in the IgG1 Fc Region by Integrated NMR and LC-MS Analysis

本文创新性地整合甲基核磁共振（NMR）、甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）选择性酶促还原及肽图（LC-MS）分析技术，建立了可在残基与立体化学层面解析IgG1抗体Fc区甲硫氨酸（Met）氧化的综合分析框架。研究揭示了溶剂暴露的Met252相较于埋藏Met428更易氧化，且二者氧化产物均存在R/S型立体异构体，其构象互扰直接影响抗体Fc受体（FcRn/FcγR）结合功能，为治疗性抗体的质量评估与理性设计提供了原子水平的结构机理洞察。

　　

单克隆抗体作为重要的生物治疗药物，其临床疗效与药代动力学特性高度依赖于分子结构的完整性。在众多化学降解途径中，甲硫氨酸（Met）氧化是一种关键的后翻译修饰，尤其会影响抗体Fc区域中保守的Met²⁵²与Met⁴²⁸位点，进而削弱抗体稳定性、Fc受体（FcRn与FcγR）结合能力，以及相关的效应功能。然而，由于该修饰具有局部性与微扰性，其结构后果一直难以精确解析。本研究发展了一套集成分析方法，结合甲基核磁共振（NMR）光谱、选择性酶促还原与肽图（LC-MS）分析，旨在实现对IgG1抗体Fc区甲硫氨酸氧化的残基水平与立体化学水平的高分辨率表征。

实验方法部分详述了野生型（WT）与突变型（M252V与M428V）Fc片段的表达与纯化流程。通过哺乳动物细胞表达系统，并在培养基中添加L-[甲基-¹³C]甲硫氨酸，实现了甲硫氨酸甲基的特异性¹³C标记。纯化后的Fc样品经叔丁基过氧化氢（tBHP）或过氧化氢（H₂O₂)氧化处理，反应通过缓冲液交换终止。为进行立体化学分辨，实验采用了来自酿酒酵母的重组甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA），该酶可特异性还原甲硫氨酸亚砜的S型异构体。核磁共振测量在800 MHz谱仪上进行，采集二维¹H–¹³C XL-ALSOFAST–HMQC谱图，以监测甲硫氨酸甲基及其亚砜形式的化学位移变化。液相色谱-质谱（LC-MS）分析则用于肽图鉴定，并通过与合成氧化肽段对比，确定了含Met⁴²⁸亚砜的R型与S型肽段。

在结果与讨论部分，核磁共振谱图的变化清晰地展示了甲硫氨酸氧化过程。未经处理的Fc样品中，可观察到归属于Met²⁵²与Met⁴²⁸的明确甲基信号。经氧化剂处理后，这些原始信号强度减弱，并在不同的化学位移区域出现了新的信号群，分别对应于未氧化甲硫氨酸局部环境改变产生的信号以及甲硫氨酸亚砜的形成。使用高浓度H₂O₂处理后，未氧化信号完全消失，而亚砜信号仍呈现多重峰形态，表明存在结构或立体化学异质性。

通过分析甲硫氨酸定点突变体（M252V和M428V）的核磁共振谱图，研究发现这两个甲硫氨酸残基之间存在相互影响。当一个位点被突变后，另一个位点的化学位移发生改变，这与二者在Fc的C_H2–C_H3结构域界面处空间位置邻近相一致。突变体氧化后的谱图显示，每个甲硫氨酸残基氧化产生的亚砜信号均分裂为两个峰，提示每个氧化位点本身即存在两种不同的状态。

利用MsrA进行选择性还原实验，为立体化学分辨提供了关键证据。MsrA处理氧化后的野生型Fc和M428V突变体（即仅含Met²⁵²）后，一部分亚砜信号消失，证实这部分信号对应于Met²⁵²亚砜的S型异构体。然而，在M252V突变体（即仅含Met⁴²⁸）中，MsrA处理未引起显著变化，表明埋藏的Met⁴²⁸对酶的可及性较低。值得注意的是，即使去除S型Met²⁵²亚砜后，剩余的亚砜信号以及恢复的未氧化Met²⁵²信号仍显示出异质性，这表明Met²⁵²与Met⁴²⁸各自存在未氧化、亚砜R型和亚砜S型三种状态，并且它们之间的氧化状态相互影响其核磁共振信号。

最终的谱峰归属通过整合核磁共振数据和LC-MS肽图分析结果完成。通过分析不同浓度H₂O₂（0.01%至0.2%）轻度氧化产生的部分氧化样品，追踪了未氧化和亚砜区域信号的依次出现和分裂情况。LC-MS分析证实Met²⁵²比Met⁴²⁸更容易被氧化，这与二者溶剂可及性的差异一致。含有氧化Met⁴²⁸的肽段在LC-MS上可分离为两个色谱峰，分别对应其R型和S型立体异构体，而含有氧化Met²⁵²的肽段则无法通过LC-MS分辨立体异构体。定量分析表明，Met⁴²⁸亚砜的R:S比例约为55:45。基于此，并结合核磁共振信号强度，成功归属了所有观测到的甲硫氨酸及其亚砜信号的核磁共振峰，并估算Met²⁵²亚砜的R:S比例约为53:47。

本研究结论指出，整合甲基核磁共振、选择性酶促还原和肽图分析的策略，能够实现对IgG1抗体Fc区甲硫氨酸氧化的残基水平和立体化学水平的高分辨率解析。该方法揭示了Met²⁵²和Met⁴²⁸氧化如何依赖其立体化学构型和空间环境差异性地影响局部结构，这些结构扰动与FcRn结合能力下降等功能损害直接相关。该集成分析框架为在原子分辨率水平评估抗体完整性、指导设计更稳定的治疗性蛋白以及建立相应的质量保证体系奠定了坚实基础。