基于双同位素内标LC–MS/MS技术的生物基质中透明质酸精准定量方法开发与验证

《Analytical Chemistry》：Development of an Accurate Double Isotopic Standard LC–MS/MS Method for Hyaluronic Acid Quantification in Biological Matrices

本刊推荐：研究者创新开发了基于双同位素内标（100%-13C-HA与50%-13C-4-mer）和标准加入法（SAM）的LC–MS/MS方法，成功实现生物基质中透明质酸（HA）的精准定量。该方法通过重组透明质酸酶（RSK）酶解生成Δ4-mer寡聚体，有效校正酶解效率与质谱响应波动，在牛玻璃体液（BVH）和人滑液（HSF）中展现出优异线性（r2>0.99）、高回收率（>90%）与低检测限（LOD≈0.15 μg/mL），为HA相关病理机制研究与临床检测提供可靠工具。

　　

引言

透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）是一种天然线性多糖，由交替的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺通过β-1,4和β-1,3糖苷键连接而成。作为细胞外基质的重要组分，HA在组织水合、关节润滑、细胞信号传导及创伤修复中发挥关键作用。其分子量分布与生理功能密切相关：高分子量HA具抗炎特性，而低分子量片段则促进炎症反应。HA代谢异常与骨关节炎、肿瘤微环境、纤维化疾病等病理过程密切相关，因此开发精准定量方法对揭示其生物学功能及临床应用至关重要。

材料与方法

同位素内标合成与表征

研究通过¹³C₆-葡萄糖生物合成法制备100%-¹³C标记HA（IS1）及50%-¹³C标记HA（用于生成IS2）。高分辨质谱（HRMS）分析证实，Δ4-mer（m/z 757.2169）与100%-¹³C-Δ4-mer（m/z 785.3071）的质谱偏移符合28个碳原子全标记理论值。MS/MS碎片离子（如m/z 554、392）进一步验证了寡聚体结构及标记效率。值得注意的是，乙酰基团中部分¹²C残留现象通过酸水解去乙酰化实验得以解析。

样品前处理与液相色谱-质谱条件

牛玻璃体液（BVH）和滑液（HSF）经稀释后，加入IS1与梯度浓度HA标准品，采用重组透明质酸酶（RSK）于37°C酶解24小时生成Δ4-mer。酶解产物经甲醇沉淀蛋白后，加入BTH酶解的50%-¹³C-4-mer作为IS2。LC-MS/MS分析使用HILIC色谱柱，以100 mM甲酸铵（pH 3）-乙腈梯度洗脱，三重四极杆质谱在负离子模式下通过多反应监测（MRM）采集m/z 757→554（Δ4-mer）、785→392（IS1）及789→199（IS2）的离子对。

定量策略与方法验证

采用标准加入法（SAM）构建校准曲线，以y=[area(Δ4-mer)/area(IS1)]/area(IS2)对加标浓度拟合线性方程，通过截距计算内源性HA含量。方法验证显示：线性范围r²>0.99；BVH与HSF中检测限（LOD）分别为0.147±0.007 μg/mL和0.143±0.028 μg/mL，定量限（LOQ）为0.491±0.022 μg/mL和0.475±0.093 μg/mL；回收率>92%。基质效应分析表明BVH存在显著离子抑制（53.23%），而HSF中效应轻微（113.15%），凸显SAM的必要性。

结果与讨论

酶解优化与内标校正效能

RSK酶解动力学研究表明，Δ4-mer在24小时达到峰值产量。通过调控酶浓度（1000-5000 U/mL）验证IS1的校正能力：未标准化时Δ4-mer峰面积变异系数（CV%）达25.2%，而经IS1标准化后降至5.8%，证明其有效消除酶活性波动引入的误差。

生物基质中HA定量

BVH与HSF中HA浓度分别为799.9±144.4 μg/mL和1101.9±151.4 μg/mL。尽管BVH测定值高于文献报道范围（50-570 μg/mL），但考虑其显著的基质效应，结果仍具合理性；HSF数值符合健康个体生理范围（1-4 mg/mL）。稳定性实验表明，两次冻融循环后HA浓度变异<20%，符合生物分析要求。

结论

本研究建立的双同位素内标LC–MS/MS方法通过整合¹³C标记内标与标准加入法，系统性校正了酶解效率、质谱响应及基质效应三大变异源，实现了复杂生物基质中HA的精准定量。该方法为HA相关疾病生物标志物研究、药物递送系统优化及临床检测提供了高可靠性分析工具。