开发并验证了一种用于测定人体尿液中有机磷阻燃剂二酯类化合物及其羟基化代谢物的方法

《Analytica Chimica Acta》：Development and validation of a method for determination of organophosphorus flame retardant di-ester and hydroxylated metabolites in human urine

高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液14种有机磷阻燃剂代谢物，优化质谱参数及色谱条件实现基线分离，检测限0.018-0.16 μg/L，加标回收率72.2%-109.6%，精密度5.1%-14.7%，评估基质效应77.2%-112.3%。方法通过Analytical Greenness Metric和Blue Applicability Grade Index验证环境可持续性，已应用于中国国民生物监测计划。

　　

余小红|邱天|王静宇|罗青青|沈通|卢一夫|史晓明

安徽医科大学公共卫生学院，中国合肥230032

摘要

背景

作为评估人体接触有机磷阻燃剂（OPFRs）的生物标志物，准确测量尿液中的OPFRs代谢物（mOPFRs）对于评估其健康影响至关重要。

结果

我们建立了一种高通量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，用于同时定量人体尿液中的14种mOPFRs，包括二酯类和羟基化代谢物。尿液样品经过固相萃取后，用2%的氨化甲醇溶液洗脱，通过氮气流浓缩，最后在原始流动相中重新配制，然后使用LC-MS/MS进行分析，分析模式为电喷雾离子化和多反应监测。基于离子碎片模式实现了高灵敏度的质谱信号采集。通过调整流动相洗脱强度实现了异构化合物的基线分离。提高提取效率和纯化效果基于准分子性质。该方法的方法检测限范围为0.018至0.16 μg/L。加标回收率在72.2%到109.6%之间，相对标准偏差在5.1%到14.7%之间，基质效应在77.2%–112.3%的范围内。通过分析认证参考物质和参与不同实验室的能力评估验证了该方法的可靠性。该方法已在中国国家人体生物监测计划的框架内有效用于分析尿液中的mOPFRs，实现了环境可持续和适用的绿色评估。

意义

该方法彻底优化了质谱设置、色谱参数和样品制备程序等关键要素，为评估人群接触OPFRs和进行风险评估提供了可靠的技术支持。

引言

近年来，有机磷阻燃剂（OPFRs）作为传统溴化阻燃剂的替代品越来越受欢迎^[1]。这些物质被广泛应用于食品包装、建筑材料和消费品等领域^[2]。全球OPFRs的年消费量估计超过50万吨，其中氯化物和芳基化合物占据市场主导地位^[3]。虽然这些化合物因其阻燃效率、热稳定性和增塑性能而受到重视^[4]，但大量研究表明，OPFRs及其代谢物（mOPFRs）具有内分泌干扰作用^[5]，可能影响甲状腺功能^[6]、性激素调节^[7]和神经发育^[8]。值得注意的是，几种OPFRs，如三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）和三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（TDCPP），已被列入优先监管名单，包括加州的Proposition 65监管化学品名单^[9]。然而，OPFRs的监管政策在不同地区存在显著差异。许多发展中国家缺乏全面的监管框架来应对OPFRs，这导致了广泛的环境释放和持续的人类暴露^[10]。OPFRs可能在产品制造和使用过程中通过挥发、磨损和渗漏等途径进入环境^[11]。由于其半挥发性，这些化合物在人类生活环境中广泛分布。OPFRs经常在各种环境介质中被检测到，包括沉积物、污泥、地表水和室内灰尘^[12], [13], [14]。人类主要通过饮食摄入^[15]、皮肤吸收^[16]和吸入^[17]接触这些化合物。接触后，OPFRs的代谢主要由肝脏细胞色素P450（CYP450）酶通过I相反应介导，包括羟基化、氧化脱卤化和脱烷基化，生成羟基化和羧基化衍生物^[18]。一些代谢物通过II相结合（如葡萄糖醛酸化、硫酸化）进一步处理，以增强亲水性并促进尿液排泄^[19]。OPFRs在人体内的生物转化途径见图S1。尽管OPFRs在血液中的代谢半衰期较短，通常为几小时到一天，但其稳定的代谢物（如二苯基磷酸酯（DPhP）和双（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（BDCPP）在体内停留时间更长，最终通过尿液排出^[20]。这些代谢物可作为24至48小时内暴露的可靠指标^{[21], [22]。实证研究表明尿液代谢物与环境中的OPFRs水平之间存在显著相关性[23]。与血液采样等侵入性采样方法相比，尿液采集是非侵入性和实用的，尿液代谢物浓度被广泛用作暴露评估的标准[20]。}

由于在基于人群的研究中评估尿液mOPFRs的重要性，已经建立了一系列分析技术。评估尿液中mOPFRs的主要方法是使用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），结合液-液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）^{[24], [25]}。美国疾病控制与预防中心（CDC）采用的SPE结合LC-MS/MS方法是全球最广泛采用的技术之一^[26]。然而，该方法仅限于六种常见的二酯类代谢物，忽略了包括羟基化代谢物在内的新兴暴露生物标志物，并且无法实现异构化合物di-o-苯基磷酸酯（DoCP）和di-p-苯基磷酸酯（DpCP）的基线分离，因此它们被一起定量。立体异构体DoCP和DpCP分别是三-o-苯基磷酸酯（ToCP）和三-p-苯基磷酸酯（TpCP）的生物标志物。ToCP在室温下具有较高的挥发性和神经毒性及心脏毒性，而TpCP则没有这些毒性^{[27], [28]。因此，同时定量多种生物标志物可能导致对三苯基磷酸酯的风险评估不准确。李等人[29]建立了一种使用LLE进行样品萃取和净化的方法，可以分辨这两种立体异构体。然而，引入氯化钠以提高离子强度会缩短仪器寿命，并需要更频繁地清洁离子源。此外，重复的LLE过程劳动强度大且需要更多溶剂，使得该方法不够可持续。此外，现有方法在优化流动相组成和样品体积的同时，没有同时评估基质效应（ME）对定量准确性的影响。因此，本研究旨在开发一种能够准确识别和定量多种目标化合物的方法，同时有效减轻基质效应。}

本研究重点开发并验证了一种结合SPE与LC-MS/MS的方法，用于同时测定人体尿液中的14种mOPFRs，包括二酯类和羟基化代谢物。彻底优化了质谱设置、色谱参数和样品制备程序等关键要素。通过分析认证参考物质和参与实验室间能力评估来评估该方法的可靠性。此外，还使用分析绿色度量指标（AGREEprep）和蓝色适用性等级指数（BAGI）仪器评估了该方法的环境可持续性。该技术已在中国国家人体生物监测（CNHBM）中得到有效应用，为评估人群接触OPFRs和进行风险评估提供了可靠的技术支持。

章节片段

化学物质和试剂

mOPFRs的标准及其相应的内部标准（IS）来自Alta Scientific Co., Ltd.（中国天津）。总共十四种mOPFRs和十三种IS的物理化学特性及其相应的母体化合物详细信息见补充材料（表S1和S2）。图1展示了所研究物质的化学结构和缩写。HPLC使用的甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、乙酸（HAc）和甲酸（FA）

质谱参数选择

在本研究中，使用了ESI源，该源在正离子化和负离子化模式下均可工作以识别目标化合物。在ESI过程中，带电液滴会发生库仑裂解，形成准分子离子^[33]。通常，正离子化模式适用于碱性化合物，因为它们可以容易地获得质子形成正电荷离子，而负离子化模式更适合酸性化合物^[34]。目标分析物为

结论

在本研究中，我们成功建立了一种结合LC-MS/MS的SPE方法，用于同时测定14种尿液中的mOPFRs。系统优化了关键参数，包括离子化效率、色谱分离和提取效率。在ESI负离子化模式下，氯化mOPFRs的灵敏度和信号响应显著提高。使用BEH C18柱和ACN与MeOH（8:2, v/v）的混合溶剂实现了基线分离

CRediT作者贡献声明

余小红：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据整理。沈通：撰写——审阅与编辑。罗青青：正式分析。王静宇：撰写——原始草稿、正式分析。邱天：撰写——原始草稿、方法学、正式分析。史晓明：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思。卢一夫：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、概念构思

免责声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（82388102, 82025030, 82530104, 82241091）、国家重点研发计划（2022YFA0806600）、中国CDC青年科学家科学基金（2023A201）以及中国CDC国家环境卫生研究所青年科学家科学研究基金（2025YSR01）的支持。