从未剥皮且未成熟的哈斯鳄梨（Persea americana Mill.）中提取生物活性化合物：采用超临界二氧化碳的顺序提取方法

《Biomass and Bioenergy》：Extraction of bioactive compounds from unpeeled and unripe Hass Avocado ( Persea americana Mill.): A sequential extraction methodology using supercritical CO 2

本研究采用超临界CO2分步萃取技术，从未成熟Hass avocado果肉及果皮中富集α-生育酚、类胡萝卜素及叶绿素a、b，优化温度（40/60°C）与压力（150-320 bar）条件。结果表明前三阶段（150-250 bar）叶绿素选择性更高，阶段2-3的α-生育酚含量达61.16 mg/100g，显著优于传统方法。该绿色技术实现高值化利用，提升油品抗氧化性与商业应用潜力。

　　

莫妮克·费雷拉·莱亚尔（Monique Ferreira Leal）|费尔南多·路易斯·佩莱格里尼·佩索阿（Fernando Luiz Pellegrini Pessoa）|拉克尔·马萨德·卡瓦尔坎特（Raquel Massad Cavalcante）|苏埃利·佩雷拉·弗雷塔斯（Suely Pereira Freitas）

巴西里约热内卢联邦大学化学学院

摘要

牛油果（Persea americana Mill. cv. Hass）富含不饱和脂肪酸和脂溶性生物活性化合物。本研究采用超临界二氧化碳（supercritical CO₂）进行连续提取方法，从两种不同的生物基质（未去皮果肉和去皮果肉）中提取油脂，旨在提高α-生育酚、总类胡萝卜素和叶绿素a、b的含量。实验在40°C和60°C下，分别施加150、200、250、300和320巴的压力，共进行了五次连续提取。评估了油脂的回收效率、生物活性化合物的含量、化学组成和热稳定性。前三个提取阶段（150–250巴）在两种温度下均表现出较高的叶绿素回收选择性，随后选择性逐渐下降。总类胡萝卜素几乎均匀分布于所有提取物中，其中未去皮果肉在40°C和320巴条件下的含量最高（14.59 ± 0.13毫克/100克）。α-生育酚是最丰富的生物活性化合物，在两个温度下第二和第三阶段的回收效果最佳。未去皮果肉在60°C和250巴条件下的最高浓度为61.16 ± 0.39毫克/100克。总体而言，超临界二氧化碳连续提取（SE-scCO₂）工艺能够选择性回收具有商业价值的营养化合物，尤其是α-生育酚，其浓度超过了以往的报道值。在指定的操作参数下，该工艺对具有商业价值的营养化合物具有选择性，尤其是α-生育酚的含量较高。

引言

牛油果（Persea americana）原产于墨西哥，主要分为三个品种：墨西哥品种、西印度品种和危地马拉品种。这种富含油脂的水果因其生物活性分子（包括类胡萝卜素和酚类化合物）而备受重视。其脂肪酸对心血管疾病的相关风险因素具有有益作用[1]。

关于食用油的研究已扩展到食品工业以外的多个领域，包括医药[2]、化妆品[3]和可再生能源[4]。关于牛油果油的科学研究强调了其在预防氧化应激和胰岛素抵抗方面的潜力，同时开发了创新的提取技术并实现了副产品的增值[5,6]。Araújo等人[7]强调了牛油果副产品中生物活性化合物的潜力。牛油果的种子尤其是果皮富含酚类化合物，具有较高的抗氧化活性。未成熟果实的果皮中叶绿素和类胡萝卜素的含量随着果实成熟度的增加而减少。研究表明，哈斯（Hass）牛油果在收获早期阶段的脂溶性植物化学物质（如生育酚）含量显著高于完全成熟时[8,9]。未成熟的哈斯牛油果在脂肪酸和酚类化合物方面优于成熟果实[10,11]。利用超临界流体提取等先进提取方法可以增强这些特性，因为这些方法注重化合物的稳定性和生物活性的保持。化妆品行业对牛油果油的需求不断增加，这得益于其保湿性能和高维生素E含量[12,13]。'哈斯'品种以其高脂质含量而著称[14]，并含有多种生物活性化合物，如植物甾醇、叶绿素和类胡萝卜素[15]。

采后处理对牛油果的品质影响显著。酶促褐变主要是由多酚氧化酶（PPO）引起的，该酶会催化酚类化合物氧化生成深色黑色素[16]。尽管也有研究探讨了非PPO底物的相关途径[17]，但促进褐变的关键因素包括高温、光照和氧气存在[18]。

由于牛油果含水量高，干燥是高效提取油脂的必要步骤。对流干燥在100°C以上温度下会因细胞壁硬化而降低提取效率。虽然冷冻或微波干燥等替代技术对油脂质量的影响较小[19]，但长时间处理可能会引起酚类化合物的氧化降解[20,21]。为减轻干燥过程中的酶促褐变，需要采取热处理[22]或浸入柠檬酸溶液[23]等酶失活策略。

从未去皮果肉中提取的油脂通常具有更好的抗氧化稳定性，因为果皮中含有较高浓度的酚类化合物，可以抑制脂质过氧化。此外，农业副产品（如牛油果果皮和种子）的增值是循环经济和生物精炼概念的基本原则，有助于更合理地利用生物质并将废弃物转化为高价值的功能性化合物。通常在加工过程中被丢弃的牛油果果皮已成为具有公认抗氧化能力的生物活性化合物的潜在来源[19,24]。

传统方法（压榨或溶剂提取）生产的食用油中含有理想的生物活性化合物，但也含有色素（如叶绿素）和氧化产物等不希望存在的物质。去除这些污染物对于提升产品的感官品质和抗氧化性能至关重要。然而，漂白剂可能对环境造成危害，并可能促进微生物污染[25]。

超临界二氧化碳（scCO₂）提取作为一种绿色且高效的替代传统有机溶剂的方法，已被广泛用于植物生物质的增值。该方法促进了循环生物经济的发展，使原材料、副产品和农业废弃物能够转化为高附加值化合物。多项研究证实了超临界流体提取（SFE）的有效性，例如从藜麦种子中回收富含生育酚的油脂[26]，以及从玫瑰果籽等食品工业废弃物中提取油脂[27]。scCO₂还成功分离了迷迭香中的肉桂酸、迷迭香酸和色素[28]。该技术还被用于从罐装沙丁鱼废弃物中回收有价值的生物活性脂质，实现食品工业副产品的增值[29]。此外，还从Acacia dealbata花朵中获得了高纯度、浓缩且无溶剂的精油[30]。不同类型的微藻中也回收到了多种有价值的化合物（脂质、色素和抗氧化剂[31]。石榴果实副产品中的生物活性成分也被选择性分离出来，将这些农业废弃物转化为功能性食品成分[32]。此外，该技术还扩展到了工业领域，通过液化松木制备液体生物油，使其应用范围超越了食品领域，扩展到了工业生物材料[33]。

尽管scCO₂提高了生物活性化合物的回收选择性和效率，但其主要缺点是极性较低，可以通过使用极性共溶剂来改变其极性，从而增强其提取目标化合物的能力。此外，通过调节压力和温度可以改变二氧化碳（CO₂的物理化学性质（如密度、扩散性和介电常数），从而调整其选择性和溶剂性能。分馏过程可以实现更高的选择性，从而分离或浓缩复杂基质中的特定化合物。化合物在scCO₂中的溶解度受工艺参数（压力和温度）的影响，了解溶解行为及溶剂能力随压力和温度的变化对于确定选择性提取的操作条件至关重要[34],[35],[36]。

一种先进的方法是连续超临界二氧化碳提取（SE-scCO₂），该方法通过逐步增加溶剂极性（通常是通过提高压力）来针对不同类型的化合物[37]。连续提取是一种有前景的策略，首先使用纯CO₂提取非极性化合物（如脂质和脂溶性物质），然后使用乙醇或乙醇/水混合物等共溶剂提取极性化合物（如多酚）。作为一种可持续技术，scCO₂提取的提取物在功能特性方面优于冷压提取，尤其是在α-生育酚和类胡萝卜素含量方面。然而，提取效果很大程度上取决于果实的成熟度、含水量和品种特性[40]。

文献中报道了许多关于使用超临界二氧化碳提取哈斯牛油果果肉的研究。然而，尚未有人应用这种方法处理未成熟的哈斯牛油果（未去皮果肉）。本研究采用超临界二氧化碳连续提取方法，旨在在不使用共溶剂的情况下提高目标生物活性化合物（特别是α-生育酚和总类胡萝卜素）的含量。实验分为五个连续阶段，仅通过改变提取过程中的压力和温度条件来实现这些化合物的分级和浓度提升。此外，所得到的提取物可在多个工业领域得到应用，不仅在化妆品、食品、营养保健品和制药领域有价值，还有潜力用于可再生能源生产。

原材料和化学品

原材料：未成熟的哈斯牛油果（Persea americana Mill. cv. Hass）来自巴西里约热内卢的CADEG（瓜纳巴拉州供应中心）。这些果实来自圣保罗的Jaguacy农场，该农场采用生物农药来控制哈斯牛油果虫害[41]。

化学品：乙醚（P.A.，Sigma-Aldrich?）；二氧化碳（CO₂，纯度99.95%，Linde Gás?提供）；0.01N氢氧化钾（KOH，Sigma-Aldrich）；标准脂肪酸甲酯混合物（n-C14至C22，Agilent提供）

原材料预处理

未成熟牛油果的平均重量为204.59 ± 17.50克，经过热处理后降至183.12 ± 25.52克。副产品占总果重的约43%，其中果皮占16.94 ± 3.54%，种子占25.92 ± 5.20%。这些数值高于文献中关于成熟哈斯牛油果的数据（副产品约占30%，果皮约14%，种子约16%[65,66]）。

在60°C下干燥后，果肉呈现浅绿色，表明酶促反应成功进行

结论

本研究开发的超临界二氧化碳连续提取（SE-scCO₂）方法被证明是一种选择性强的分离工艺，能够从未成熟哈斯牛油果果肉中有效回收生物活性化合物（BACs）。该方法使用纯超临界二氧化碳（无需有机共溶剂），在40°C下的总脂质产量为44.41克/100克，在60°C下为52.04克/100克。

CRediT作者贡献声明

莫妮克·费雷拉·莱亚尔（Monique Ferreira Leal）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法设计、数据分析、概念构建。 费尔南多·路易斯·佩莱格里尼·佩索阿（Fernando Luiz Pellegrini Pessoa）：指导、审稿与编辑、方法设计、概念构建。 拉克尔·马萨德·卡瓦尔坎特（Raquel Massad Cavalcante）：撰写、审稿与编辑、指导、资源管理、项目协调、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突可能影响本文的研究结果。