用于分析7-酮胆固醇及相关甾醇的现代质谱方法

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Current Mass Spectrometry Methods for the Analysis of 7-Ketocholesterol and Related Sterols

7-酮胆固醇及相关甾醇的质谱联用分析技术综述，重点讨论前处理中避免体外自动氧化干扰的方法，强调其在脂质储存疾病和Smith-Lemli-Opitz综合征中的诊断价值及定量挑战。

　　

威廉·J·格里菲斯（William J Griffiths）| 莫赫森·阿里·阿斯加里（Mohsen Ali Asgari）| 王玉琴（Yuqin Wang）

斯旺西大学医学院，英国威尔士斯旺西市辛格尔顿公园（Singleton Park, Swansea SA2 8PP）

摘要

本文总结了目前用于分析7-酮胆固醇（7-ketocholesterol）及相关甾醇的质量光谱方法，重点介绍了各种方法的优点，并强调了分析前和分析过程中的注意事项，以避免这些氧化甾醇的体外生成。

引言

7-酮胆固醇（7-KC，也称为7-氧胆固醇，7-OC）自20世纪40年代以来就引起了生物化学家的兴趣。Bergstr?m和Wintersteiner的研究表明，7-KC可以与7α-羟基胆固醇（7α-HC）和7β-羟基胆固醇（7β-HC）一起通过体外自氧化过程形成[1]、[2]、[3]。他们通过旋光法、紫外吸收法以及与合成化合物的比较来鉴定7-KC。他们指出：“这种类型的自氧化过程在体内也有可能发生”，并与同事Johana Ritzmann一起从马血清中分离出了7-KC，但也提到“另一方面，分离过程中至少有一部分产物可能是体外形成的”[2]。后来，Bergstr?m的研究方向转向了前列腺素领域[4]，最终与Bengt Samuelsson和John Vane共同获得了1982年的诺贝尔生理学或医学奖。Bergstr?m的学生Jan Sj?vall曾与他合作，首次以结晶形式分离出前列腺素[4]、[5]，并继续在胆固醇研究领域开展工作，特别是胆汁酸领域，发现了具有7-氧-5-烯结构特征的C₂₄和C₂₇胆汁酸[6]、[7]。虽然7-氧-5-烯胆汁酸极不可能是体外样品制备过程中的伪产物，但7-KC本身却不同，因为胆固醇在样品中的含量通常比7-KC高出数千倍[8]。研究人员必须始终意识到，即使只有1%的胆固醇发生体外自氧化，也可能会产生相当数量的7-KC。

尽管包括作者在内的许多甾醇和氧化甾醇领域的研究人员对生物样本中7-KC的内源性含量相关结果持怀疑态度[9]、[10]，但如今已明确证实7-KC可以通过胆固醇的内源性自氧化形成，尤其是在溶酶体贮积症[11]、[12]、[13]、[14]、[15]等情况下，以及通过7-脱氢胆固醇（7-DHC）的酶促转化形成（如Smith-Lemli-Opitz综合征（SLOS）[7]、[17]）。然而，7-KC的下游酶促代谢产物可能是更可靠的生成标志物，因为这些产物不太可能是样品处理过程中的伪产物，同时可能具有更大的生物学意义[6]、[7]、[18]。

质谱（MS）或串联质谱（MS/MS或MS²）结合气相色谱（GC）或液相色谱（LC）已被证明是分析和定量7-KC及相关甾醇的最佳技术。在以下部分中，我们将讨论这些方法及其样品制备程序。本文主要关注人类血浆和血清样本，因为这是最常见的生物研究样本。

部分内容摘录

GC-MS

目前使用的许多GC-MS方法都基于Dzeletovic等人的经典研究[19]。该方法用于分析人体血浆中的多种氧化甾醇，包括7-KC。其关键特点包括：(i) 在血浆制备过程中使用乙二胺四乙酸（EDTA）和丁基化羟基甲苯（BHT），其中EDTA作为金属离子的螯合剂，BHT作为抗氧化剂；(ii) 在皂化前加入同位素标记的标准品（包括[²H₆]7-KC）。

讨论

7-KC可以通过胆固醇的体外氧化形成。这是一个问题，因为胆固醇的含量通常比7-KC高1000倍，因此测量得到的7-KC值应谨慎对待。然而，7-KC的内源性形成现已得到明确证实：(i) 在Smith-Lemli-Opitz综合征中，7-KC是CYP7A1酶对7-DHC氧化的产物（该病患者的7-DHC水平升高）；(ii) 在溶酶体贮积症（如NPC、ASMD和Wolman病）中，7-KC的非酶促形成。

结论

长期以来，许多氧化甾醇领域的学者都忽视了7-KC在生物化学中的重要性。但事实证明，7-KC确实可以内源性生成。然而，其测量具有一定的挑战性，因为胆固醇的体外自氧化总是可能发生，从而影响7-KC的定量结果。

人类样本

血浆样本来自被诊断为溶酶体贮积症的患者或实验室对照样本。所有参与者或其父母均根据《赫尔辛基宣言》提供了书面知情同意书，研究得到了机构审查委员会的批准。

作者贡献声明

王玉琴（Yuqin Wang）：资金筹集、初稿撰写、审阅与编辑。 莫赫森·阿里·阿斯加里（Mohsen Ali Asgari）：审阅与编辑、数据分析。 威廉·J·格里菲斯（William J Griffiths）：研究概念的提出、资金筹集、初稿撰写、审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：威廉·J·格里菲斯表示获得了英国研究与创新机构（UK Research and Innovation）和威尔士政府的资金支持；他与CholesteniX有限公司存在关联（包括股权或股票）。王玉琴也与CholesteniX有限公司存在关联（包括股权或股票）。

致谢

我们感谢英国研究与创新机构（UKRI，项目编号MR/Y008057/1、BB/S019588/1）和欧盟通过欧洲结构基金（ESF）提供的资金支持，这些资金用于威尔士政府资助的“学术专家助力商业”项目。为了实现开放获取，作者对本文提交的任何接受发表的手稿版本采用了CC BY公共版权许可。同时，我们也感谢Christopher Titman博士和Shimadzu UK有限公司提供的仪器支持。