《Methods》：Novel methods for the discovery of disease-associated T cell epitopes in autoimmunity
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为攻克自身免疫病治疗中T细胞靶向疗法开发的关键瓶颈——自体反应性T细胞表位鉴定难、现有方法敏感性与通量不足等问题，Eline Mertens等研究者系统梳理了该领域的关键技术与前沿进展。本综述不仅总结了从基础免疫学到高通量计算与质谱技术的表位发现策略，还深入探讨了候选抗原的免疫原性验证方法，旨在为开发精准的抗原特异性疗法提供全面的理论与方法学框架。
探索免疫系统的“内鬼”：自身免疫病中T细胞靶点的发现之旅
当人体的免疫防御系统“敌我不分”，错误地攻击自身组织时，便引发了自身免疫病。从类风湿关节炎到多发性硬化症，这类疾病影响着全球约10%的人口，其病因复杂，治疗棘手。当前的主流疗法，如免疫抑制剂，虽能缓解症状，却像“地毯式轰炸”一样无差别地抑制整个免疫系统，带来感染和肿瘤风险升高的副作用。因此，医学界将目光投向了更精准的“斩首行动”——抗原特异性疗法。这种疗法的核心在于精准识别并靶向那些驱动疾病的、针对特定自身抗原（即“自身靶点”）的T细胞，从而在不损害整体免疫功能的前提下重建免疫耐受。然而，要实现这一美好愿景，首要且最关键的步骤便是找出这些致病T细胞所识别的精确目标——T细胞表位（T cell epitopes）。
这绝非易事。T细胞表位的发现之路充满挑战：首先，自身反应性T细胞在健康人群中也可能存在，只是频率和功能状态可能不同；其次，这些致病T细胞在患者体内通常频率极低，难以检测；再者，从蛋白质抗原到最终被T细胞受体（TCR）识别的表位，需要经历复杂的抗原加工、与主要组织相容性复合体（MHC，在人类中亦称人类白细胞抗原HLA）结合、以及被特定TCR识别等多个环节，任何一环的差异都可能导致不同的免疫结局。此外，翻译后修饰（如瓜氨酸化）或肽段剪接等现象还会产生新的自身靶点（新抗原），进一步增加了鉴定的复杂性。
为了系统梳理这一快速发展的领域，为研究者提供方法学“地图”，Eline Mertens, Barbara Willekens, Judith Derdelinckx和Nathalie Cools在《Methods》上发表了题为“Novel methods for the discovery of disease-associated T cell epitopes in autoimmunity”的综述。这篇文章旨在提供一个关于自身免疫病中T细胞表位发现技术的结构化概览，既涵盖早期发现自身表位的基础技术，也囊括了提供更高精度和可扩展性的最新高通量方法，并讨论了这些表位在自身免疫病中作用的验证技术，最后展望了该领域的未来方向。
关键技术方法纵览
研究人员在文中系统比较了多种表位发现与验证技术。在候选表位鉴定方面，方法包括：基于已知抗原的合成肽段文库刺激、用于无偏发现的定位扫描肽库（PS-SCL）、基于酵母或昆虫细胞展示的高通量文库筛选、以及直接鉴定体内呈递肽段的免疫肽组学（Immunopeptidomics）质谱技术。在T细胞活化与表型检测方面，常用技术有增殖实验（如CFSE染色）、酶联免疫斑点（ELISpot）、酶联免疫吸附（ELISA）、流式细胞术胞内因子染色及细胞因子捕获实验。对于T细胞克隆型研究，则涉及光谱分型（Spectratyping）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）。此外，文章还详述了用于富集体内已激活T细胞的特殊培养策略，如利用白细胞介素-2（IL-2）刺激或6-硫鸟嘌呤（6TG）选择。
研究发现与结论
1. T细胞在自身免疫病中的核心角色与表位发现挑战
该部分明确了CD4+和CD8+T细胞是自身免疫病理的核心媒介。胸腺中的阳性和阴性选择旨在清除高自反应性T细胞，但机制并非完美：某些自身抗原无法在胸腺中呈现，导致特异性T细胞逃逸删除；阴性选择仅清除高亲和力T细胞，低亲和力但高亲合力（avidity）的自身反应性T细胞可能逃脱并在外周引发疾病。此外，外周组织中的翻译后修饰（如类风湿关节炎中的瓜氨酸化）或肽段剪接（如1型糖尿病中的杂交胰岛素肽）可产生“新自身抗原”，打破免疫耐受。这些因素共同构成了T细胞表位发现的四大核心挑战：（i）抗原加工途径依赖（蛋白酶体/免疫蛋白酶体 vs. 溶酶体组织蛋白酶），（ii）肽段与MHC结合的能力，（iii）MHC基因的高度多态性导致个体间呈递肽段的差异，（iv）TCR的交叉反应性（可识别多达106种不同肽段）。
2. T细胞表位发现方法大全
本部分系统梳理了从候选表位鉴定到T细胞克隆分析的完整技术链条（总结于文内Table 2）。
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计算预测工具：是表位发现流程的先导，用于从大量蛋白序列中优先筛选候选肽段。MHC结合预测（如NetMHCpan）已较为成熟，尤其是对MHC-I。MHC-II预测和抗原加工预测（如NetChop）仍在改进中。TCR特异性预测是新兴领域，但性能仍有局限。
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肽段库筛选：
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合成肽段：是刺激T细胞最直接灵活的方法，可用于绘制抗原的免疫优势表位或研究修饰肽段（如瓜氨酸化肽）的免疫原性。
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定位扫描肽库（PS-SCL）：允许无偏发现T细胞克隆识别的表位，通过分析每个氨基酸位置的偏好性来推断可能识别的天然肽段，曾用于发现多发性硬化症中GDP-L-岩藻糖合酶的新抗原。
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展示文库：用于高通量筛选TCR结合的pMHC，例如在酵母表面展示随机肽段-MHC复合物，用可溶性TCR进行多轮筛选富集，以鉴定未知的TCR配体。
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免疫肽组学：通过质谱直接分析从APC或病变组织MHC分子上洗脱的肽段，能发现体内真实加工和呈递的表位，并能鉴定翻译后修饰产生的表位，在发现1型糖尿病的杂交胰岛素肽等新抗原中发挥了关键作用。
3. 候选疾病相关自身抗原免疫原性的评估与验证
鉴定出候选表位后，需严格验证其与疾病的相关性。这涉及：
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样本来源：可选择外周血单个核细胞（PBMC）或病变部位组织（如滑膜液、脑脊液），后者可能富含病原性T细胞。
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T细胞富集与活化检测：
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富集策略：可采用抗原刺激扩增，或利用IL-2受体表达、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）突变筛选、端粒长度测量等方法选择性富集体内已激活的T细胞。
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活化读数：包括增殖实验（如CFSE、BrdU掺入）、细胞因子分泌检测（ELISA, ELISpot, FluoroSpot, 胞内染色、细胞因子捕获 assay）。其中，细胞因子捕获 assay能在单细胞水平检测细胞因子分泌并保持细胞活性，利于后续分选和分析。
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T细胞克隆型分析：通过光谱分型或单细胞TCR测序（scTCR-seq）分析T细胞克隆的扩增情况，寻找疾病相关的克隆型，但其抗原特异性仍需通过上述方法确定。
研究结论与意义
本综述系统性地整合了自身免疫病T细胞表位发现领域的经典实验方法与新兴计算及高通量技术，为研究者提供了一个兼顾实用性与概念性的框架。文章强调，对疾病相关T细胞表位的精准鉴定是开发靶向性、抗原特异性疗法的基石。尽管面临自身反应性T细胞频率低、表位识别环节复杂等多重挑战，但随着免疫肽组学、高通量展示技术、单细胞测序及人工智能预测工具的不断进步，表位发现的灵敏度、通量和分辨率正在大幅提升。
未来，该领域的发展方向在于进一步整合多组学数据（如转录组、蛋白质组、免疫肽组）、开发能更好预测MHC-II结合及抗原加工的计算工具、以及建立更强大的TCR-表位互作预测模型。通过跨学科合作，持续优化这些方法，将加速我们对自身免疫病病理机制的解析，并最终推动更安全、更有效的个性化免疫疗法的诞生，为数以亿计的自身免疫病患者带来新的希望。
