《Microchemical Journal》：Ratiometric dual-mode ECL–SERS biosensing of miR-21 via PER-primed CRISPR/Cas12a on CsPbBr?@COF-LZU1@Au
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本设计开发了一种单电极双模式生物传感器，结合CsPbBr3@COF-LZU1@Au纳米结构，通过PRME-Cas12a递送机制实现高灵敏、特异性检测，ECL检测限1.71 aM，SERS 2.14 aM，比值法1.51 aM，适用于癌症诊断。
梁正芳|陈进|左国利|李俊宏|魏继华|龚元勋|任浩珍|唐倩莉|张凯|廖先久
中国广西百色右江民族医学院附属医院，广西骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室，533000
摘要
我们报道了一种单电极双模式生物传感器，该传感器在CsPbBr?@COF-LZU1@Au纳米杂化物上集成了阳极电化学发光（ECL）和表面增强拉曼散射（SERS）技术。钙钛矿核心在三丙基胺（TPrA）作用下产生明亮的、水稳定的ECL信号；超薄COF壳层提供了多孔限制和化学锚定作用；而周围的Au纳米点则形成了电磁热点，并增强了Au-S键的稳定性。一个铁氰化物标记的发夹结构（Fc-HP）将Fe-C中心定位在亚纳米至几纳米（约0.5–3 nm）的Au–COF–钙钛矿纳米间隙内，通过距离依赖的淬灭效应实现了深度的ECL关闭。目标识别通过引物交换反应（PER）得到放大，该反应激活CRISPR/Cas12a酶对表面DNA进行切割，从而将Fe-C从纳米间隙中移除，使ECL信号恢复并减弱SERS信号，这一过程是同步且依赖于目标分子的。数据采集顺序为先SERS后ECL，以避免界面干扰。在优化条件下（PER 80分钟，Cas12a浓度60 nM，电极上切割45分钟，TPrA浓度70 mM），合成miR-21的信号在1 aM至1 nM范围内呈现九个数量级的对数线性关系：标准化ECL强度随log??C增加，SERS（Fc）强度随log??C降低，比率指数R = I_ECL/I_SERS(Fc)在同一范围内也呈线性。IUPAC检测限分别为1.71 aM（ECL）、2.14 aM（SERS(Fc)）和1.51 aM（比率指数）。该平台对非靶标序列和错配序列具有高选择性，重复性优异（电极间RSD约为3%），并且在4°C下7天内信号保留率约为92–96%。在实际样本中，内源性miR-21的浓度遵循MCF-7 > HeLa > HEK293的预期趋势，并通过匹配样本的校准实现了准确的检测。模块化的PER→Cas12a识别机制和协同设计的纳米间隙转换器使得该传感器能够实现对其他microRNAs和核酸生物标志物的敏感定量分析。
引言
microRNAs（miRNAs）是一类小型非编码RNA，通常长度约为22个核苷酸，它们通过与目标mRNA的3′非翻译区（UTR）结合来调节基因表达。这种调节机制包括抑制翻译或诱导mRNA降解。miRNAs在细胞分化、发育、凋亡和增殖等多种生物过程中起着关键作用[1]、[2]、[3]、[4]。miRNAs的表达异常与多种疾病相关，尤其是在癌症中，miRNAs既可以作为致癌基因也可以作为肿瘤抑制因子。监测和定量生物样本中的miRNA水平对于诊断、个性化医疗和治疗监测具有重要意义。
在众多miRNAs中，miR-21因其在家谱系癌症（如乳腺癌、肺癌和结直肠癌）中的过度表达而成为了一个突出的生物标志物。miR-21通过靶向关键肿瘤抑制基因（如PTEN）以及参与细胞周期调控、凋亡和转移的通路来促进肿瘤发生[5]、[6]、[7]、[8]。因此，miR-21不仅是早期癌症检测的潜在标志物，也是治疗干预的目标。因此，开发高灵敏度和特异性的miR-21检测方法对于推进癌症诊断和治疗策略至关重要。
目前，miRNAs的检测主要依赖于定量聚合酶链反应（qPCR）、Northern印迹和微阵列分析等技术。尽管这些方法具有高灵敏度和特异性，但它们通常需要复杂的样本处理、昂贵的设备和专业知识，这限制了它们在常规临床应用中的普及性和实用性。为了应对这些挑战，人们迫切需要更简单、成本更低、效率更高的检测技术，以实现快速准确的结果。
近年来，电化学生物传感器作为miRNAs检测的替代方案受到了广泛关注。这些传感器具有高灵敏度、便携性和实时检测的潜力，非常适合用于即时检测。电化学发光（ECL）[9]和表面增强拉曼光谱（SERS）[10]是两种常用于生物传感器平台的技术。ECL具有高灵敏度和低背景噪声，非常适合检测超低浓度的miRNAs[11]、[12]；而SERS则提供了分子指纹识别能力，能够以高空间和光谱分辨率检测特定生物分子[13]、[14]、[15]、[16]。
增强ECL和SERS信号的最有前景的材料之一是钙钛矿与金属有机框架（MOFs）在纳米复合结构中的组合。CsPbBr?作为一种铅卤化物钙钛矿，由于其优异的电化学性质、高发光效率和在水环境中的稳定性，已成为高效的ECL发射体。当将其整合到复合结构中时，CsPbBr?可作为基于ECL的生物传感器的强大发射体。为了进一步提升性能，将多孔有机框架COF-LZU1引入结构中，为钙钛矿提供了稳定的环境并促进了功能基团的锚定。加入Au纳米颗粒（AuNPs）后，通过产生局部电磁场进一步增强了SERS效应，放大了金属纳米表面的拉曼信号。这些材料的协同作用形成了一个双模式检测的强大平台：ECL提供了高灵敏度的定量分析，而SERS则实现了高分辨率的分子指纹识别[17]、[18]、[19]。
最近开发的一种钙钛矿–COF杂化双模式ECL/SERS生物传感器通过调节Fe-C报告基团与Au热点和CsPbBr?域之间的距离，实现了可切换的ECL关闭/SERS开启与ECL开启/SERS关闭的行为。在该设计中，目标分子是NF-κB p50，切换逻辑是通过p50与DNA结合来阻止Exo III酶的切割，从而控制触发剂的释放和Fe-C的报告基团的招募。相比之下，本研究的目标是miR-21，并采用了不同的生化前端机制：引物交换反应（PER）生成激活剂以启动CRISPR/Cas12a酶，激活的核酸酶在电极上进行切割，将Fe-C报告基团从纳米间隙中移除，从而恢复ECL信号并减弱SERS信号。尽管这两种方法都采用了类似的钙钛矿–COF–Au转换机制和比率抗相关性，但我们的目标类型、放大途径（PER→Cas12a）和激活机制（旁路切割与外切酶门控招募）存在根本差异。
在这项研究中，我们旨在开发一种集成ECL和SERS的双模式生物传感器，用于检测miR-21。所提出的生物传感器利用了CsPbBr?@COF-LZU1@Au纳米复合平台，该平台表现出强烈的ECL发射和SERS增强效果。该平台的设计旨在实现协同效应：ECL信号用于测量miR-21的浓度，而SERS则进一步确认目标miRNA的存在。通过结合这两种强大的技术，我们的生物传感器旨在实现高灵敏度、特异性和重复性，从而实现更可靠的诊断和治疗监测。
试剂、寡核苷酸和仪器
分析级CsBr、PbBr?、三丙基胺（TPrA）、K?[Fe(CN)?]/K?[Fe(CN)?]、KCl、乙醇、N,N-二甲甲酰胺（DMF）、间二甲苯、1,4-二氧环己烷、冰醋酸、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、6-巯基-1-己醇（MCH）、牛血清白蛋白（BSA）和Nafion均按原样使用。实验过程中始终使用超纯水（18.2 MΩ·cm）。LbCas12a（Cpf1）DNA聚合酶、dNTPs和含Mg2?的缓冲液均购买自商业渠道。
HPLC纯化的核酸包括：
所提出生物传感器的原理
传感界面通过将所有无机钙钛矿纳米晶体限制在超薄的亚胺连接的COF内部，并在外表面装饰离散的Au纳米点来构建（CsPbBr?@COF-LZU1@Au）。CsPbBr?在TPrA共反应物作用下作为阳极ECL发光体。多孔的COF壳层（约2–3 nm）钝化了表面陷阱，提供了锚定位点，并定义了纳米级间隔。离散的Au纳米点（约3–10 nm）形成了亚10 nm的电磁热点。
结论
我们开发了一种双模式生物传感平台，该平台在单一的共工程化CsPbBr?@COF-LZU1@Au界面上集成了阳极电化学发光（ECL）和表面增强拉曼散射（SERS）。钙钛矿核心在TPrA作用下产生明亮的、水稳定的ECL信号；超薄的COF壳层提供了多孔限制和化学锚定作用；周围的Au纳米点形成了电磁热点，并增强了Au-S键的稳定性。
CRediT作者贡献声明
梁正芳：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、资源获取、方法学设计、概念化。陈进：可视化、验证、项目管理、方法学设计、数据分析、概念化。左国利：验证、监督、项目管理、方法学设计、资金获取、形式分析、概念化。李俊宏：资源获取、项目管理、方法学设计、数据分析、资金获取、
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢以下机构的财政支持：国家自然科学基金（82260887）、广西自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、生命科学分析化学国家重点实验室（SKLACLS2314）、广西骨与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（21-220-06-202205）、百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-38-05）。
