基于分子印迹技术的电化学传感器，利用全转钴胺素（holotranscobalamin）作为生物标志物来检测维生素B12

《Microchemical Journal》：Molecular imprinting based electrochemical sensor for determination of vitamin B12 using holotranscobalamin as biomarker

新型分子印迹聚合物（MIP）电化学传感器用于高灵敏度holoTC检测，优化了印迹因子（4.24）、模板移除时间和层厚度，检测限达0.061 pg/mL，并通过Ab-thn抗体验证特异性，在血清样本中表现稳定且优于传统方法。

　　

作者：Rishika Rohilla、Ankit、Amandeep Kaur、Nirmal Prabhakar

印度昌迪加尔旁遮普大学生物化学系，邮编160014

摘要

本文开发了一种基于分子印迹聚合物（MIP）的伏安传感器，用于快速检测全转钴胺素（holoTC），这是一种潜在的维生素B12缺乏症生物标志物。通过将holoTContoAu/ZIF-8修饰的FTO固定在电极表面，随后进行苯酚的电聚合，并移除固定的holoTC分子，从而创建了用于识别holoTC的人工识别元件。为了成功形成针对holoTC的特异性结合位点，优化了印迹因子、模板去除时间、MIP层厚度以及holoTC的孵育时间。使用多种物理和电化学技术对改性的MIP电极进行了表征。通过差分脉冲伏安法（DPV）检测发现，holoTC浓度的线性范围为0.01 pg/mL^-1至100 ng/mL^-1，最低检测限为0.061 pg/mL^-1。由于硫辛素的电活性，使用硫辛素偶联抗体（Ab-thn）进一步增强了传感器的电化学响应。针对不同干扰物对holoTC-MIP传感器选择性的测试表明，这些干扰物并未显著影响检测结果，该传感器的选择性较高（印迹因子为4.24）。该传感器在40天内表现出稳定的响应，并具有良好的重复性（RSD值≤3.9%）。在实际应用中，该方法用于检测人血清样本中的holoTC，并与总维生素B12检测方法进行了比较。研究结果具有高度重复性，且优于传统方法。这是首次报道基于分子印迹技术的holoTC伏安检测方法。

引言

开发旨在模仿天然识别框架的合成类似物是当前研究人员高度关注的领域之一。在这方面，具有嵌入聚合物分子腔体的传感器（称为分子印迹聚合物，MIP）因其独特的识别分析物能力而受到关注[1]、[2]。MIP的合成涉及在模板或目标分子存在下聚合功能性单体和交联剂。聚合完成后，模板分子从聚合物基质中分离出来，留下一个与分析物分子形状和大小完全匹配的腔体。因此，该腔体中形成的分子记忆使模板能够有效且选择性地识别并结合其目标分子。MIP也被视为一种人工或塑料抗体，相比天然生物识别元件（BREs）具有许多优势[3]。与天然BREs不同，MIP在温度和pH等不利生理条件下仍能正常工作，从而降低了存储成本，并为目标分子提供了额外的热稳定性和选择性[4]。此外，MIP的制备过程是一个化学过程，不需要复杂的仪器，因此更易于生产和重复使用[5]、[6]。可以使用多种策略制备MIP，其中将功能性单体直接电聚合到电极表面是最适合的方法，因为它可以在短时间内形成薄聚合物膜[7]。由于其氧化潜力，甲基蓝、苯胺、吡咯、多巴胺、3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）和苯酚衍生物等功能性单体可用于印迹模板[8]。

最近，Piskin等人（2024年）开发了一种基于MIP的伏安传感器，用于电化学检测L-乳酸。4-氨基苯甲酸被聚合到ZIF-8@ZnQ支持的GCE电极上，用于检测L-乳酸，该传感器的检测限为29.9 fM[10]。Kodokat等人（2022年）使用苯酚作为印迹聚合物制备了高选择性的GCE传感器，用于检测鸟嘌呤，检测限低至8 × 10^-8 M[11]。Qadar等人（2019年）开发了一种基于MIP的伏安传感器，用于检测二硫酮（DSN），使用聚苯酚作为分子印迹聚合物，检测限为0.183 μM[12]。 然而，像聚苯酚这样的聚合物在电极上的导电性较差且直接制备会导致传感器电化学惰性，从而降低灵敏度[13]。为了解决这个问题，采用了将导电纳米材料与活性表面积结合的通用方法[14]、[15]、[16]。复合纳米材料（如金属有机框架（MOFs）由于结构可调性、丰富的活性位点以及热稳定性和化学稳定性，具有优于单一纳米材料的电化学性能[17]。沸石咪唑框架-8（ZIF-8）是一种MOFs亚类，由过渡金属离子（Zn^2+）和咪唑衍生物作为中心离子组成[18]。ZIF-8结合了金属离子和咪唑的优点，具有较大的比表面积和高孔隙率以及优异的稳定性[19]。为了进一步提高导电性，添加了金纳米颗粒（Au NPs）等导电纳米材料以增强信号放大，从而提高了传感器的灵敏度。Au NPs在电化学生物传感器的开发中是一个显而易见的选择，因为它们具有稳定性、功能化、低毒性和良好的生物相容性[20]、[21]、[22]。

在这项工作中，我们在掺氟氧化锡（FTO）电极表面构建了一种基于MIP的新传感器，该电极经过ZIF-8/Au修饰，用于检测全转钴胺素（holoTC）。holoTC是维生素B12缺乏症的敏感且潜在的生物标志物[23]。在印度，由于大多数人口是素食者，而维生素B12的主要来源是动物性食品，因此维生素B12缺乏非常普遍[24]。钴胺素（维生素B12）缺乏的主要后果是恶性贫血，会导致情绪冷漠[25]、记忆力丧失[26]、萎缩性胃炎[26]、乳头萎缩[27]以及神经系统严重损伤[24]。因此，使用合适的生物标志物在早期阶段检测这种缺乏症至关重要。血清中的钴胺素与两种转运蛋白结合：haptocorrin（HC）和transcobalamin（TC）。HC携带了大部分维生素B12（约80%，非活性形式），而TC仅携带少量（6-20%），并且是唯一可被细胞用于代谢功能的钴胺素形式[28]。因此，测量holoTC（活性维生素B12）在临床上比测量总维生素B12更有意义[29]。目前检测维生素B12缺乏的方法包括总维生素B12测定[30]、放射免疫测定[31]、holoTC免疫测定[32]和高效液相色谱[25]，这些方法都需要高技术技能、复杂的样品预处理和昂贵的设备。此外，这些方法的灵敏度有限，导致假阳性结果较多，因此迫切需要提高灵敏度和选择性[33]。

在不同的转换器系统中，电化学伏安技术因其高精度和准确性而成为首选[34]、[35]。开发伏安传感器的主要优点包括快速测试、操作简便、高灵敏度、良好的重复性以及低成本检测多种生物分析物[36]。然而，据我们所知，目前尚未有基于MIP的电化学生物传感器用于检测holoTC。本研究旨在开发一种高灵敏度的新型生物传感器，该传感器以分子印迹技术为基础，通过形状、大小和化学功能来识别holoTC。同时引入了第二识别元件Ab-thn（带有硫辛素的holoTC特异性抗体），以确认holoTC在人工结合位点中的存在。引入硫辛素抗体的原因是硫辛素是一种电活性化合物，在-0.2 V时表现出特征性电响应，因此它在结合holoTC时起到示踪作用。尽管这提高了MIP传感器的电化学性能，但本研究的主要目标是开发成本低廉、适用于现场检测的一步检测策略。因此，定量校准曲线仅基于holoTC与MIP腔体的特异性结合建立，而Ab-thn则用于证明双重识别的可行性及其在未来应用中的增强检测潜力。

化学品和设备

holoTC蛋白购自印度北方邦的Real-gene公司。抗-holoTC抗体由美国ABclonal公司提供。掺氟氧化锡玻璃片（FTO，电阻率约为7 Ω/sq.）、硝酸锌四水合物（Zn(NO3)2·4H2O）、N-丁胺、三水合氯化金（HauCl4·3H2O）、2-甲基咪唑（CH3C3H2N2H）、N-二甲基甲酰胺（DMF）、硫辛酸酯盐和半胱氨酸由美国Sigma Aldrich私人有限公司提供。二氢磷酸钠二水合物（NaH2PO4）也由该公司提供。

材料选择

复合纳米材料（如金属有机框架（MOFs）由于其结构可调性、丰富的活性位点以及热稳定性和化学稳定性而具有优异的电化学性能。沸石咪唑框架-8（ZIF-8）结合了金属离子和咪唑的优点，具有较大的比表面积和高孔隙率以及优异的稳定性（Kaur等人，2024年）。然而，需要使用金纳米颗粒（Au NPs）等导电纳米材料。

实验条件优化

为了提高传感器的性能，优化了多种反应条件，如MIP层厚度、holoTC去除时间、holoTC孵育时间和磷酸盐缓冲液的pH值。

基于MIP的holoTC检测及LOD的确定

为了评估MIP传感器的分析效果，在给定的优化条件下记录了不同holoTC浓度下的DPV峰电流：MIP层沉积20次循环、holoTC孵育45分钟、holoTC去除30分钟。在这些实验条件下，将MIP电极与不同浓度的holoTC（10 μL，范围从0.01 pg/mL^-1到100 ng/mL^-1）孵育45分钟。用0.1 M磷酸盐缓冲液清洗后进行电化学测试。

基于MIP的平台在血清样本分析中的应用

使用人血清样本评估了所提出的MIP传感器的可靠性和实际可用性。从四名个体（S1、S2、S3和S4）随机收集新鲜血液样本，并按照我们之前的工作描述的方法收集相应的血清[45]。随后使用该传感器对血清样本进行了电化学检测，以估算holoTC的含量。电极制备和伏安测量的程序如下：

结论

所提出的传感器使用分子印迹聚合物作为生物识别元件，成功替代了天然生物识别元件，从而显著降低了传感器的成本。此外，使用Au/ZIF-8进行信号放大大大提高了电化学MIP传感器对holoTC的分析性能。在优化的实验条件下，传感器的LOD为0.061 pg/mL^-1（动态范围0.01至10^5 pg/mL^-1），选择性高（IF = 4.24）。

作者贡献声明

Rishika Rohilla：撰写原始草稿、方法学设计、数据分析、概念化。 Ankit：数据验证、数据管理。 Amandeep Kaur：数据验证、实验研究。 Nirmal Prabhakar：撰写、编辑、监督、资源协调。

资助

本研究得到了旁遮普大学博士奖学金计划的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢SAIF/CIL（旁遮普大学，昌迪加尔）在表征研究中的支持。同时，作者也非常感谢Suman Singh博士（CSIR-CSIO）在接触角测量方面的帮助。