基于液相色谱技术的地中海大型藻类化学表征及其抗氧化分子研究

《Journal of Separation Science》：Chemical Characterization of Mediterranean Macroalgae With a Focus on Antioxidant Molecules Through the Use of Liquid Chromatographic Techniques

这篇综述重点阐述了利用液相色谱（HPLC）结合不同类型检测器（FLD、PDA、MS）对10种地中海大型藻类（红藻、褐藻、绿藻）进行多种抗氧化活性分子（维生素C、维生素E、维生素B12以及类胡萝卜素和色素）的全面化学表征方法。研究旨在推动藻类在食品、营养保健品和制药工业中的潜在应用，契合可持续蓝色经济和2030年议程目标。

　　

1 引言

全球人口增长、资源枯竭和气候变化要求采用新的可持续方法来供养快速增长的世界人口。海藻是一种尚未被充分开发的生物质资源，不仅可作为可持续蓝色经济的蛋白质来源，还可应用于生物燃料生产和作为健康食品与营养保健品的替代来源。本文聚焦于对来自地中海区域的10种大型藻类（包括四种红藻、四种褐藻和两种绿藻）进行化学表征，以评估其高抗氧化活性微量营养素（维生素C、E、B₁₂以及类胡萝卜素和色素）的含量。通过开发并验证一系列高效液相色谱（HPLC）方法，旨在为扩大藻类在食品、营养保健品和制药工业中的应用潜力提供数据支持，同时保持金融和生物资源的循环性。

东亚人群自古食用藻类，证实了其对健康的积极影响，如降低肥胖、糖尿病、心脏病和癌症风险，以及延长寿命。藻类的维生素含量通常比陆地植物高出10-20倍，尤其值得注意的是，维生素B₁₂主要存在于动物源性食品中，而某些藻类含有钴胺素化合物，这为遵循纯素饮食的个体提供了重要优势。

2 材料与方法

2.1 化学品与试剂

研究所用试剂均为HPLC级或分析纯，包括甲醇（MeOH）、水、正己烷（Hex）、2-丙醇（IPA）、甲基叔丁基醚（MTBE）等，以及抗坏血酸（维生素C）、氰钴胺（维生素B₁₂）和各类生育酚（维生素E）的标准品。

2.2 样品

分析了10个大型藻类样品，包括3个红藻（角叉菜、掌状红皮藻、紫菜属）、4个褐藻（指状昆布、糖海带、长角藻、裙带菜）和1个绿藻（石莼）的商业食用品种，以及从亚得里亚海北部沿海泻湖采集的2种野生藻类（石莼和江蓠属）。样品详细信息见文中表1。

2.3 维生素E分析

采用冷法提取维生素E，以甲醇破坏藻类细胞壁，正己烷提取脂溶性分子。使用正相高效液相色谱（NP-HPLC）系统配合荧光检测器（FLD）进行分离和检测。该方法经过验证，具有良好的线性、灵敏度（LOD和LOQ）、精密度（日内和日间）和准确度。

2.4 维生素C分析

维生素C采用酸化水溶液（m-磷酸）提取，以保护其免受光和空气降解。使用配备光电二极管阵列（PDA）检测器的反相高效液相色谱（RP-HPLC）系统进行分析。为减少复杂基质的影响，采用标准加入法进行绝对定量。该方法同样经过全面验证。

2.5 维生素B₁₂分析

维生素B₁₂采用酸化甲醇/水溶液在避光条件下提取。使用配备单四极杆质谱仪（LCMS-2020）和电喷雾（ESI）接口的RP-HPLC系统进行分析。为提高灵敏度，采用选择离子监测（SIM）模式。定量分析也采用标准加入法，方法经过验证。

2.6 类胡萝卜素和色素分析

类胡萝卜素和色素采用丙酮/甲醇混合物提取，使用配备PDA和大气压化学电离（APCI）接口质谱检测器的RP-HPLC系统进行分析。利用C30柱实现分离，并通过质谱和紫外光谱的互补性进行化合物鉴定。

3 结果与讨论

3.1 维生素E含量

在所有分析的样品中均检测到维生素E，主要为α-生育酚，γ-生育酚仅在两个样品中检出。含量最高的两个样品均为褐藻：裙带菜（Undaria pinnatifida， 商品名Wakame）含量为1.54 ± 0.08 mg/kg，长角藻（Himanthalia elongata）含量为0.84 ± 0.01 mg/kg。野生石莼和江蓠也含有可观的α-生育酚。其他商业样品的维生素E含量显著较低（0.05–0.19 mg/kg），表明在储存或加工（如干燥）过程中可能发生了降解。分析方法显示出高灵敏度（α-生育酚和γ-生育酚的LOD分别为0.05和0.02 mg/kg）、良好线性（R²= 0.9998）以及较高的准确度和精密度。

3.2 维生素C含量

仅在两个样品中检测到维生素C：褐藻长角藻（72.9 mg/kg）和红藻紫菜属（Porphyra sp.， 商品名Nori）（20.2 mg/kg）。这表明藻类中维生素C的含量受遗传、地理和加工因素影响较大，且易降解。所建立的方法快速、简单，主要使用水作为提取介质和流动相，具有较好的绿色性和实用性（BAGI实用性评分为77.5）。方法的LOD和LOQ值较低（0.004–0.08 mg/kg），准确度和精密度均符合要求。

3.3 维生素B₁₂含量

维生素B₁₂同样仅在两个样品中检测到：褐藻指状昆布（Laminaria digitata， 商品名Kombu）（96.4 μg/100 g）和红藻紫菜属（39.6 μg/100 g）。文献中关于藻类B₁₂含量的报道存在很大差异，紫菜属物种已被报道含有显著量的B₁₂，本研究结果与此一致。所建立的方法通过减少溶剂消耗和用2-丙醇替换流动相中的甲醇，提高了绿色性。但由于需要使用质谱检测器，其绿色性（AGREE评分）和实用性（BAGI评分）略低于维生素E和C的分析方法。

3.4 类胡萝卜素和色素

类胡萝卜素是具有抗氧化活性的油溶性分子，对预防衰老及相关疾病有益。研究鉴定出的类胡萝卜素包括岩藻黄质、叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素及其异构体。

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  岩藻黄质：是褐藻中的主要类胡萝卜素。在裙带菜中信号最强（> 500 mAU），在长角藻和指状昆布中信号较弱（< 10 mAU）。9-(Z)-岩藻黄质异构体在所有分析的褐藻中均有检出。图1对比了三种褐藻的HPLC-PDA色谱图。
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  叶黄素和玉米黄质：在绿藻和部分红藻中检出。野生石莼样品中叶黄素信号强烈，并伴有少量9-(Z)-叶黄素异构体，而商业石莼样品中叶黄素信号微弱，再次表明商业处理过程可能导致成分降解。野生石莼样品中还含有叶绿素衍生物和羟基-叶绿素A，而商业样品则显示出脱镁叶绿素等降解产物。图2清晰地展示了野生和商业石莼样品在类胡萝卜素和色素组成上的差异。
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  叶绿素及其衍生物：作为基本的光合色素，在所有样品中均有检出，在绿藻中含量最高，其次是褐藻裙带菜以及红藻江蓠和紫菜属。其他商业样品则显示出更强的脱镁叶绿素（降解产物）信号。

3.5 绿色性与实用性评估

使用AGREE和BAGI工具对维生素E、C、B₁₂的分析方法进行了绿色性和实用性评估。所有方法均展现出良好的实用性（BAGI评分 ≥ 70），表明其适用于常规分析。与传统方法相比，通过减少样品和试剂用量、避免使用有毒抗氧化剂（如BHT）、使用水作为主要溶剂等措施，提高了方法的绿色性（AGREE评分 ≥ 0.55）。图3展示了三种维生素分析方法的AGREE和BAGI评估结果。

其中，维生素B₁₂分析方法因需要使用质谱检测器，在能耗方面得分较低。

4 结论

本研究开发并验证了一系列稳健且经济实用的分析方法，用于测定地中海大型藻类中的抗氧化分子和维生素B₁₂。这些方法在实用性（BAGI评分 ≥ 70）和绿色性（AGREE评分 ≥ 0.55）方面均表现良好。

研究证实，在所有分析的藻类样品中均存在维生素E，而维生素C和B₁₂仅在两种藻类（包括广泛食用的紫菜，商品名Nori）中检出。

类胡萝卜素作为重要的抗氧化成分，在广泛食用的裙带菜（Wakame）和野生石莼样品中含量最为丰富。

本研究旨在扩展对野生和商业大型藻类化学成分的认识，以探索其在食品、营养保健品和制药工业中的潜在应用，从而支持金融和生物资源的循环利用。