在细胞超结构和生物材料的三维微纳尺度分析方面的进展对于揭示基本生物学过程以及加速结构生物学、组织工程、再生医学和先进生物成像等关键生物医学领域的进展至关重要。目前，包括电子显微镜[[1], [2], [3]]、探针显微镜[4,5]和光学显微镜[6,7]在内的多种先进显微技术正在积极开发并应用于生物医学研究，这一点在最近的综述中已有详细讨论[8]。其中，荧光光学显微镜（Fluorescence Optical Microscopy, FOM）技术因其能够精确定位与生物分子和生物结构相关的荧光标记物而具有特殊意义，为了解生命系统的功能组织提供了关键见解。然而，传统的三维FOM方法（包括共聚焦和超分辨率技术）在轴向分辨率方面存在显著限制，通常在500纳米到几微米之间，远低于其横向分辨率[9]。
为了克服这一限制，一种有效策略是通过分析超薄切片来物理限制被检测样本段的厚度，类似于透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）[10]的做法。现代超薄切片技术能够制备出厚度从几十纳米到几百纳米的超薄切片，这些切片适合后续的光学和电子显微镜分析。通过对连续切片的数字处理，还可以精确重建生物样本中的三维纳米结构。然而，生物样本通常需要嵌入专门的环氧树脂中，类似于TEM中使用的制备方法。
通常，超薄切片是通过配备水浴的精密金刚石刀的超薄切片机（Ultramicrotome, UMT）制备的，切片在切割后漂浮在水面上。已经开发了自动化或半自动化系统（如ATUMtome系统（Boeckeler Inc., USA）来帮助将这些连续切片收集到特制的碳涂层聚合物带上[11]。然后可以使用光学或扫描电子显微镜对这些切片进行分析。这种方法相比传统的共聚焦显微镜提供了更高的轴向分辨率，因为分辨率直接对应于切片厚度（例如，之前研究显示为100纳米[11]），并且不会随着成像深度的增加而降低。此外，涉及连续切片的方法可以有效消除失焦荧光，大大提高了轴向分辨率。另一种类似的系统ARTOS 3D（Leica Microsystems GmbH, Austria）允许在专门的刀具浴中收集连续切片[10]。
在三维相关超显微镜技术中的一个有前景的最新发展是将超薄切片技术与FOM和扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy, SPM）相结合，这种方法被称为荧光光学探针纳米断层扫描（Fluorescence Optical-Probe Nanotomography）[12,13]。我们团队和其他研究者的先前工作[[14], [15], [16], [17], [18]]确定了确保可靠的高分辨率三维相关成像所需的几个关键条件。这些条件为具体的硬件要求和设计策略提供了依据。首先，为了避免切片过程中常见的形态学变形（如压缩、振动、起皱等），应在每次超薄切片后立即在样本块的新暴露表面上进行SPM测量。
其次，由于每次切割都会更新块面，因此在同一UMT切割循环中同时进行原位SPM和FOM测量是必不可少的。这使得可以进行交互式的相关分析，并根据荧光数据精确定位SPM探针，这比依赖单独收集连续切片的传统方法具有优势。最后，为了保持最佳分辨率和相关性，FOM成像必须在每次切片步骤后立即在样本表面上进行，使用的景深应与超薄切片的厚度相匹配或更小。因此，本研究的主要目标是：开发并验证独立的荧光光学纳米断层扫描（Fluorescence Optical Nanotomography, FONT）技术，用于高分辨率的三维荧光成像；并设计并构建一种新型的专用显微系统，能够在单次UMT切割循环内实现对样本块面的原位SPM访问。这种结合SPM-FONT的策略显著提升了我们在纳米尺度上观察和表征生物结构的能力。在目前的工作中，我们首先展示了FONT本身的能力，然后详细介绍了其与SPM整合的实现路径，从而提出了一种克服现有方法关键限制的完整解决方案，为生物医学研究和诊断提供了前所未有的复杂细胞结构洞察。
