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本综述介绍并验证了一种创新的高通量功能性筛选平台——RASP。该方法通过利用纯化的五价单域抗体（VHH）展示噬菌体直接进行病毒中和试验，颠覆了传统抗体发现范式，能够在早期阶段直接筛选出具有中和活性的VHH，从而显著加速抗病毒单域抗体的发现进程，在应对新发病毒疫情方面具有重要的应用潜力。
研究背景与目标
单域抗体（VHH），也称为纳米抗体，来源于骆驼科和软骨鱼类（如鲨鱼）的重链抗体（HCAb）。它们体积小、稳定性高，并且拥有较长的互补决定区3（CDR3），能够结合传统抗体难以接近的表位，因此在诊断和治疗应用中备受青睐。传统的抗体发现方法，如噬菌体展示，通常仅以抗体-抗原结合作为唯一筛选标准。尽管通量高且稳健，但这些方法常需大量后续实验来鉴定具有中和功能的VHH，费时费力。为此，本文提出了一种名为“基于五价噬菌体展示的快速抗体功能筛选”（RASP）的新方法，旨在直接在功能性层面筛选抗病毒VHH。
RASP的核心原理与优势
RASP方法的核心在于，使用超噬菌体（Hyperphage）产生的五价VHH展示噬菌体（每个噬菌体表面展示五个拷贝的VHH）来进行病毒中和试验。这与传统的辅助噬菌体（Helper phage）产生的单价展示噬菌体形成对比。研究发现，五价VHH噬菌体在中和病毒（如携带SARS-CoV-2刺突蛋白的重组水泡性口炎病毒rVSV-SARS-CoV-2-GFP和呼吸道合胞病毒RSV）感染方面，其效率显著优于单价展示的噬菌体，即使在高感染复数（MOI）条件下也能有效中和。这得益于五价展示带来的更高的VHH密度和更均一的展示效果。该方法将功能性筛选步骤提前，能够直接识别出具有中和活性的候选抗体，从而大幅缩短发现流程。
半合成VHH库的构建
为了验证RASP方法，研究团队设计并构建了一个半合成VHH噬菌体展示库。他们从蛋白质数据库（PDB）中检索VHH序列，分析了CDR区的多样性，并基于氨基酸频率和CDR3长度分布设计了库的组成。该库的理论多样性极高，经下一代测序（NGS）验证，其实际构建库的CDR区氨基酸分布和长度分布与设计目标高度一致。
作为过滤方法的RASP (RASP as a Filtering Method)
研究首先利用传统的噬菌体展示技术，使用SARS-CoV-2重组刺突蛋白对库进行淘选（Panning）。经过多轮淘选，通过噬菌体酶联免疫吸附试验（ELISA）和NGS，鉴定出多个结合能力强的候选VHH，其中一些是富集程度最高的“热门序列”。然而，当研究人员将这些热门候选VHH（通过NGS从第三轮淘选中挑选的Top 10序列）表达为Fc融合蛋白（VHH-Fc）或展示在噬菌体上进行测试时发现，并非所有强结合者都具有中和活性。例如，在测试的Top 10 VHH-Fc中，有6个表现出中和能力，而其余4个仅为结合者。更关键的是，当使用这些候选VHH制备的五价噬菌体进行中和试验（RASP）时，只有3个能够中和病毒，这与后续的VHH-Fc功能验证结果有较高的吻合度。这表明，RASP可以作为一种有效的过滤器，在大量结合候选者中提前筛选出具有功能潜力的抗体，避免对非中和性结合抗体进行不必要的下游分析。
作为独立筛选方法的RASP (RASP as a Screening Method)
为了进一步评估RASP作为独立筛选平台的效力，研究团队将其应用于针对其他病毒（埃博拉病毒rVSV-EBOV-GFP和胡宁病毒rVSV-JUNV-GFP）的VHH发现。在这两个案例中，他们对比了三种筛选方法：I) 传统噬菌体ELISA筛选（基于结合）、II) RASP筛选（基于五价噬菌体的中和功能）、III) NGS富集分析（基于序列）。
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针对rVSV-EBOV-GFP的筛选：从272个克隆中，方法I（ELISA）仅筛出5个结合阳性克隆，其中仅有1个在后续验证中表现出中度中和能力。方法II（RASP）则直接筛出了24个能在细胞中和试验中表现出活性的克隆，其中8个在后续的VHH-Fc验证中被证实为有效的中和抗体。方法III（NGS）挑选的Top 20序列，在后续的VHH-Fc验证中均未表现出显著的中和能力。
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针对rVSV-JUNV-GFP的筛选：结果类似。方法I筛选的结合克隆中，仅少数表现出中和活性。方法II通过RASP直接筛选出了多个具有中和潜力的克隆。方法III的Top序列再次未能产出有效的中和抗体。
这些结果表明，与传统的结合筛选（ELISA）或序列富集分析（NGS）相比，RASP作为直接的功能性筛选方法，能够更有效、更可靠地识别出具有实际中和病毒能力的VHH候选分子。
讨论与意义
RASP平台的主要优势在于其“功能优先”的筛选逻辑。它通过使用易于制备的五价VHH噬菌体，将耗时的功能验证步骤整合到高通量的初级筛选中，从而显著加快了抗体发现的速度。此外，研究还证实了使用VSV假病毒系统进行直接淘选的可行性。同时，超噬菌体产生的五价噬菌体在维持基因型与表型关联性方面优于辅助噬菌体，减少了筛选过程中因重组导致的假阴性或假阳性。当然，RASP的局限性在于它需要依赖于带有报告基因（如GFP）的病毒系统来实现高通量的功能读数。尽管如此，作为一个模块化平台，RASP既可以独立使用，也可以无缝集成到现有的噬菌体展示或NGS流程中，作为功能验证的强大前置工具。在抗体工程领域快速发展的今天，RASP为从大型库中快速发现针对病毒糖蛋白的功能性纳米抗体提供了一种高效、可靠的解决方案。
