解锁双金属MnCo-MOFs中的强氧化酶活性：基于纳米酶的免疫测定方法，用于快速检测结节性皮肤病病毒蛋白

《Analytica Chimica Acta》：Unlocking Potent Oxidase-like Activity in Bimetallic MnCo-MOFs: A Nanozyme-based Immunoassay for Rapid Detection of a Lumpy Skin Disease Virus Protein

LSD病毒ORF-122蛋白检测中，通过钴掺杂锰钴金属有机框架（MnCo-MOF）构建H2O2-free氧化酶样纳米酶，实现10分钟内0.0355 μg/mL检测限，基于抗体抑制引发纳米颗粒聚集的显色免疫分析法，为现场诊断提供新策略。

　　

王明珠|邓元杰|朱子翔|周成如|万波|孟玲洁|田洪|王彦欣|郑海雪|赵晓萍

河南农业大学兽医学院，中国郑州450046

摘要

背景

块状皮肤病（LSD）日益严重的经济威胁要求开发出快速、便捷的现场诊断工具，以克服传统方法的局限性。目前基于纳米酶的检测方法通常依赖于不稳定的过氧化氢（H?O?）。我们的目标是设计一种高效、无需H?O?的类氧化酶（OXD-like）纳米酶，以实现更简单、更可靠的LSD病毒（LSDV）现场免疫检测。

结果

合成了一种双金属锰钴有机框架（MnCo-MOF），通过战略性钴掺杂实现了强大的内在类氧化酶活性，从而能够进行直接比色反应。通过将特异性抗体结合到MnCo-MOF表面，开发出了一种免疫检测方法。目标LSDV ORF-122蛋白会阻塞纳米酶的活性位点并引发颗粒聚集，从而抑制催化信号。该方法在10分钟内即可检测到0.0355 μg/mL的ORF-122蛋白，表现出优异的特异性。

意义

本研究首次提出了无需H?O?的纳米酶免疫检测方法，用于检测关键的LSDV蛋白，为现场疾病监测提供了实用工具。该方法揭示了一种强大的设计策略——在双金属MOF中释放强大的类氧化酶活性，为新一代现场可部署的诊断工具提供了坚实的基础。

引言

块状皮肤病（LSD）是一种由块状皮肤病病毒（LSDV）引起的急性传染病，对畜牧业和农业产业造成了重大经济损失[1]。因此，开发准确、快速、可靠的诊断工具是有效控制和最终根除LSD的关键步骤。聚合酶链反应（PCR）[2]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[4]、CRISPR技术[6]等实验室方法具有高灵敏度和特异性，但由于依赖复杂设备和专业人员，限制了其在现场的应用。为弥补这一差距，人们致力于开发现场检测方法。例如，Cavalera等人的工作开发了针对LSDV p32蛋白的快速免疫层析试纸[8]。同时，Kassem等人开发的荧光分子印迹聚合物（MIP）传感器等无抗体平台也在提高稳定性[9][10]。尽管取得了这些进展，当前的诊断工具在实现超高灵敏度、操作简便性和成本效益之间的平衡方面仍存在根本限制。

比色方法是填补这一空白的理想选择[11][12][13]。它们具有便携性、成本效益高且能提供快速结果。然而，传统比色方法的性能往往受到信号放大效率低下的限制，尤其是由于传统生物酶的不稳定性和高成本。基于纳米酶的比色检测方法具有前景[14][15]。纳米酶具有与天然酶相当的酶活性，由于稳定性高、成本低、制备容易和产率高等优势，已在生物传感领域得到广泛应用[16][17][18][19]。例如，Tang等人开发了双金属系统，如双金属CuFe/Fe普鲁士蓝类似立方体[16]和Co-Mn双金属氧化物[17]，这些系统由于金属中心之间的协同效应表现出显著增强的过氧化酶样（POD-like）活性。这种增强活性已在先进的生物传感平台中得到应用，包括使用脂质体中的空心普鲁士蓝纳米酶进行多模式信号放大的复杂系统[14]。同样，Pranjal Chandra团队报道了一系列具有过氧化酶样活性的金属树枝状纳米酶探针，用于快速检测H?O?和GSH[20][21]。他们的研究还开发了一种金纳米树枝状体和镍有机框架（AuND/Ni-MOF）纳米杂交传感器，作为H?O?检测的强大过氧化酶模拟物[21]。尽管在其他领域取得了成功，但基于纳米酶的传感器在LSDV诊断中的潜力仍大部分未被探索。

其中，金属有机框架纳米酶（MOFzymes）因其可调结构、大表面积和丰富的活性位点而受到广泛关注[22]。然而，大多数高活性的MOFzymes都是类过氧化酶（POD-like）[23]，需要H?O?作为辅底物。这种对H?O?的依赖是现场应用的关键瓶颈，因为其热稳定性差，导致运输和储存困难，而其高反应性可能在复杂的生物基质（如血清）中产生虚假信号。因此，开发具有强大类氧化酶（OXD-like）活性的MOFzymes，直接利用稳定且普遍存在的大气中的氧气作为氧化剂，是创建真正实用和可靠的现场诊断系统的关键步骤[24]。

为应对这一挑战，我们设计并合成了一种掺钴的Mn-MOF（MnCo-MOF）纳米酶，其具有内在增强的类氧化酶（OXD-like）活性，可用作高性能比色免疫检测的信号探针（方案1）。钴在Mn-MOF框架中的战略性掺杂产生了丰富的氧空位，并优化了电子结构，显著增强了显色底物TMB的直接氧化。详细表征证实，这种增强效应源于Mn2?/Mn3?和Co2?/Co3?氧化还原对之间的协同催化循环，有效生成了来自环境氧的活性氧（ROS）。为了将这种先进材料转化为功能性诊断工具，将针对LSDV表面蛋白ORF-122的抗体（Ab）结合到MnCo-MOF上。该传感器基于免疫抑制机制工作，ORF-122的特异性结合物理阻塞了纳米酶的活性位点，导致多个MOF颗粒聚集，从而引起比色信号的量化下降。因此，本研究不仅提供了一个快速灵敏的LSD诊断平台，还验证了一种用于多种生物医学和兽医应用的高效、无H?O?纳米酶的设计策略。

部分摘录

MnCo-MOF纳米酶的制备

MnCo-MOF纳米酶通过微波辅助溶剂热法合成[25]。在典型实验中，将硝酸锰（II）四水合物（Mn(NO?)?·4H?O，52.7 mg）、硝酸钴（II）六水合物（Co(NO?)?·6H?O，10 mg）、三聚酸（C?H?(COOH)?，99 mg）和月桂酸（450 mg）分别溶解在甲醇中，总体积为17 mL。然后将这些溶液混合并转移到20 mL的微波反应容器中。密封后的容器被放置在...

MnCo-MOF@Ab的合成与表征

MnCo-MOF@Ab比色传感器的合成过程如图1A所示。该探针通过三步程序构建：首先通过微波辅助溶剂热法合成MnCo-MOF纳米酶；其次使用EDC和NHS激活合成的MnCo-MOF表面的羧基（-COOH）；最后将ORF-122抗体共价结合到这些活化位点上，形成稳定的酰胺键。

结论

总之，本研究提出了一种通过战略性钴掺杂在双金属MnCo-MOF中释放强大类氧化酶活性的合理设计策略。研究表明，这种显著的催化增强是由协同效应驱动的，产生了更高的氧空位密度并优化了电子结构，从而实现了直接O?活化。利用这一改进的催化平台，开发了一种简单快速的LSDV ORF-122比色免疫检测方法。

CRediT作者贡献声明

王彦欣：研究工作。郑海雪：监督、项目管理、资金获取。赵晓萍：写作——审稿与编辑、监督、方法学、研究、数据管理。王明珠：写作——初稿撰写、方法学、研究、数据分析。邓元杰：方法学、研究、数据分析。朱子翔：监督、项目管理、方法学。周成如：方法学、研究。万波：验证、监督。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22504049）、甘肃省科技计划（编号：24JRRA816）、甘肃省科技计划（编号：24ZD13NA008）、甘肃省基础研究创新团队项目（编号：24JRRA783）以及国家动物疫病控制与预防重点实验室独立研究项目（编号：SKLADCP2025LZU-01）的支持。

利益冲突声明

不存在需要声明的利益冲突。