《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Oral submucous fibrosis: Regulatory mechanism of collagen metabolism and management
口腔黏膜下纤维化（Oral submucous fibrosis, OSF）是一种慢性、隐匿且具有潜在恶变性的口腔疾病，其特征是口腔黏膜下层的进行性纤维化。这种疾病被认为是不可逆的，并且发病机制复杂，由于对其发病过程的理解尚不完全，治疗选择有限。胶原合成增加或降解减少是OSF发生发展的关键。这篇综述旨在系统阐述胶原代谢失调的核心调控机制及其管理策略。
一、 OSF胶原代谢的病因学因素
长期咀嚼槟榔被认为是OSF的主要致病因素。槟榔是槟榔块（Betel quid, BQ）的主要成分，流行病学研究显示其与OSF的发病显著相关。槟榔的咀嚼习惯、频率和持续时间极大地影响着OSF的组织病理学特征。商业包装的槟榔制品含有高浓度的槟榔，比传统自制的、槟榔含量较低的BQ导致OSF发展的速度更快。
槟榔主要由碳水化合物、粗纤维、脂肪、蛋白质、多酚（类黄酮和单宁）、生物碱和矿物质组成。长期咀嚼槟榔，特别是槟榔制品如pan masala和gutkha，会导致口腔黏膜创伤，引发原发性炎症反应，这种口腔黏膜炎可能是OSF启动的触发机制。槟榔中的生物碱槟榔碱（arecoline） 对于OSF发病机制中的成纤维细胞增殖和胶原形成至关重要。槟榔碱在熟石灰的刺激下可进一步转化为槟榔次碱（arecaidine），后者反过来促进胶原合成。此外，槟榔中的单宁能以浓度依赖的方式促进胶原结构的稳定，从而增强对胶原酶的抵抗力。槟榔提取物中高浓度的铜可能通过增强赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase） 的活性来促进纤维化活性。
咀嚼槟榔造成的局部损伤导致慢性炎症，随后释放炎症介质、细胞因子和活性氧（Reactive oxygen species, ROS），从而引发氧化应激。ROS在OSF的发生发展中扮演关键角色。唾液中的脂质过氧化物反映了局部口腔氧化应激水平，在OSF患者中表达过高。增加的ROS会损害细胞RNA、DNA、蛋白质和细胞膜等各个组分，诱导细胞毒性并最终导致细胞死亡。高水平的线粒体ROS产生可以激活自噬，而自噬与转化生长因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路之间的交互作用通过增加成纤维细胞增殖，进而增加胶原积累来促进纤维化。
刺激性因素，包括摄入辣椒、吸烟和饮酒，会加重OSF的进展。特别是，吸烟和饮酒是OSF的独立危险因素。作为吸烟基因毒性效应的主要原因，N-亚硝胺可直接诱导氧化应激和炎症，对角质形成细胞和成纤维细胞产生细胞毒性作用，并激活免疫细胞。吸烟还会释放大量ROS，促进蛋白质的结构和功能改变以及核酸损伤，参与OSF的发病机制。
二、 参与OSF胶原代谢的发病机制
1. 上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）
EMT是一个复杂的过程，其特征是上皮细胞特异性表型、细胞间粘附结构和上皮极性的丧失，以及间质细胞特征的形成，包括间质特异性标志蛋白Vimentin的过表达以及E-cadherin和β-Catenin的减少。EMT已在纤维化口腔黏膜中靠近固有层的上皮细胞中发现，与OSF的黏膜下纤维化和恶变密切相关。增加的纤维化细胞外基质硬度通过Piezo1-YAP信号转导增强了黏膜上皮细胞的EMT和增殖。高基质硬度还可以通过激活转录因子Twist的核转位来促进EMT。此外，在OSF上皮中发现分化胚胎软骨表达基因1（Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1, DEC1） 的过表达，这可能通过激活FAK/AKT信号轴诱导OSF黏膜中的EMT，从而在口腔黏膜恶变中发挥重要的促进作用。
OSF中同时检测到EMT活性和肌成纤维细胞增加。作为表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的收缩性成纤维细胞，肌成纤维细胞在组织再生和病理性纤维化的发展中起着不可或缺的作用。OSF和其他纤维化疾病中已验证存在α-SMA表达肌成纤维细胞的升高，这与OSF的严重程度相关。槟榔碱可以促进人原代颊黏膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化，并诱导上皮细胞的EMT。特别是，槟榔碱增强了EMT转录因子锌指E盒结合同源框蛋白1（Zinc finger E-box binding homeobox 1, ZEB1） 与人颊黏膜成纤维细胞中α-SMA启动子的结合。除ZEB1外，其他EMT因子如Snail、Slug和Twist也已被发现可诱导颊黏膜肌成纤维细胞的活化。此外，槟榔提取物引起的细胞损伤后产生的ROS可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）和核因子κB（Nuclear factor κ light chain enhancer of activated B cells, NF-κB）通路来调节OSF中的EMT。
2. 细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）重塑
ECM的严重失衡已在OSF中得到验证。成纤维细胞吞噬作用降解胶原是ECM生理重塑过程中的关键环节。除了结缔组织中的胶原蛋白，其他ECM蛋白，包括腱糖蛋白、串珠素、纤维连接蛋白和弹性蛋白，在OSF的早期和中期阶段表现出显著过表达，而在晚期阶段这些ECM沉积减少。ECM重塑，特别是I型胶原替代ECM分子和肌肉纤维，是导致OSF患者张口受限的原因。硬度增加的纤维化细胞外基质可以促进OSF中黏膜上皮细胞的增殖和EMT。
ECM的持续增加沉积可能归因于基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMPs）之间平衡的破坏。MMPs可促进细胞侵袭和EMT，并与ECM的降解有关。相反，经槟榔碱处理后，OSF成纤维细胞表达更高水平的TIMP-1 mRNA和TIMP-1蛋白。值得注意的是，这些经槟榔碱处理的成纤维细胞在与角质形成细胞共培养时产生更多的TIMP-1。角质形成细胞和槟榔碱的相互作用可能促进OSF中成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。此外，与正常对照相比，OSF成纤维细胞中TIMP-1和TIMP-2的分泌增加。因此，MMPs的减少和TIMPs表达的增加导致ECM中胶原沉积增强和OSF纤维化。
此外，OSF组织和经槟榔碱处理的人牙龈成纤维细胞中转谷氨酰胺酶-2（Transglutaminase-2） 的过表达可能通过交联稳定ECM蛋白。纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1） 通过抑制尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）/组织型纤溶酶原激活物（tPA）介导的纤溶酶原向纤溶酶的转化（该过程可激活MMPs和纤维蛋白溶解）来调节ECM稳态。OSF来源的成纤维细胞中发现PAI-1和tPA以及PAI-1/tPA比值的过表达。槟榔碱已被证实可导致颊黏膜成纤维细胞中PAI和tPA分泌以及PAI-1/tPA比值的增加。此外，缺氧可促进槟榔碱诱导的颊黏膜成纤维细胞产生PAI-1和ECM。缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α） 在OSF组织的成纤维细胞、上皮细胞和炎症细胞中表达增强。HIF-1α通过增加ECM修饰物和赖氨酰氧化酶诱导EMT，导致OSF纤维形成。
作为铜依赖性酶，赖氨酰氧化酶具有保守的铜结合位点，可交联胶原并增强胶原对哺乳动物胶原酶降解的抵抗力。赖氨酰氧化酶是将胶原代谢平衡向纤维化倾斜的关键酶，在OSF成纤维细胞和组织中明显上调。胱抑素C（Cystatin C） 或其编码基因CST3属于胱抑素家族，是溶酶体蛋白水解酶和半胱氨酸蛋白酶的有效抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂分泌减少可促进OSF的胶原降解。OSF组织中胱抑素C表达上调，主要由成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞表达。胱抑素C的上调直接或间接通过抑制半胱氨酸蛋白酶和稳定OSF中的胶原纤维与ECM降解相关。此外，热休克蛋白47（Heat shock protein 47, HSP 47） 是一种应激诱导的47 kDa胶原结合分子伴侣，存在于胶原分泌细胞的内质网中，在各种纤维化或胶原疾病中通常上调。HSP 47的过表达可作为OSF中前胶原加工和分泌的胶原特异性分子伴侣。经槟榔碱处理的成纤维细胞通过MEK、PI3K和COX-2信号转导通路以剂量依赖的方式表达增加的HSP 47 mRNA。脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde, MDA） 在OSF组织中上调，随着早期和中期分级的进展而增加，但在3级OSF中减少。MDA可能有助于刺激成纤维细胞和胶原产生。
3. OSF特异性非编码RNA
越来越多的证据表明，包括微小RNA（microRNAs, miRNAs）和长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）在内的非编码RNA通过调节OSF发展中的基因转录和翻译发挥着重要作用。OSF纤维化颊黏膜成纤维细胞中发现了miRNA的异常表达。特别是，OSF纤维化颊黏膜成纤维细胞显著表达增加的miR-10b、miR-21和miR-1246，而显示miR-29b、miR-200b和miR-200c的表达减少。miR-499a的T/C+C/C基因型与BQ相关OSF的风险呈正相关。
非编码RNA可能作为EMT转录因子的重要调节因子。例如，OSF病变中发现miR-200b表达减少和关键EMT转录因子ZEB2表达增加。miR-200b可下调ZEB2的表达，进而诱导α-SMA和Vimentin的减少。然而，ZEB2的敲低可减少由miR-200b缺失引起的胶原凝胶收缩和迁移能力。此外，miR-200c的过表达抑制了ZEB1和α-SMA的表达。此外，OSF组织中miR-203被发现下调，它负向调节分泌型卷曲相关蛋白4（SFRP4）并正向调节跨膜4 L六家族成员1（TM4SF1），因此参与EMT的调节。miR-203模拟物可以抑制槟榔碱诱导的细胞增殖和EMT。此外，一些EMT转录因子不仅受到miRNA的调控，而且还介导某些miRNA的表达及其功能。例如，纤维化颊黏膜成纤维细胞中Twist沉默可下调miR-10b的表达，从而导致肌成纤维细胞活化增强和α-SMA表达增加。
miRNA和lncRNA之间的相互作用也参与了各种类型纤维化的发展和进展。例如，lncRNA PCFL（pro-cardiac fibrotic lncRNA）和miR-378之间的相互作用已在心脏成纤维细胞中得到证实。PCFL上调促进成纤维细胞增殖和胶原产生，而PCFL沉默则产生相反的效果。PCFL在纤维化中表现出促纤维化作用，并作为miR-378的海绵。PCFL敲低导致miR-378过表达，而miR-378沉默则逆转了PCFL敲低对细胞增殖、胶原产生和GRB2表达的抑制作用。lncRNA H19也作为miR-29b的分子海绵，阻碍miR-29b与I型胶原3‘-UTR的直接结合。异常过表达的H19可能通过干扰miR-29b的抗纤维化作用，导致更高的肌成纤维细胞活性和纤维发生。
4. 炎症因子和生长因子
不同的细胞因子具有不同的表达模式和促纤维化作用，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF）和干扰素-α（Interferon-α, IFN-α），以及生长因子，如TGF-β，在OSF的炎症部位合成。越来越多的证据表明，炎症细胞因子是OSF的早期发病过程。特别是，TNF是炎症反应以及胶原和胶原酶转录调节的关键介质，可能通过调节胶原代谢影响OSF的发病机制。在OSF血清中检测到促纤维化细胞因子白细胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β、IL-6和IL-8的过表达。在OSF患者中发现外周血单个核细胞产生的抗纤维化IFN-γ减少，尽管与正常对照相比，OSF组织活检中IFN-γ表达很少或没有。
槟榔碱刺激的结缔组织中生长因子的合成在颊黏膜成纤维细胞中以剂量和时间依赖性方式增加。根据先前的研究，OSF过表达TGF-β1、TGF-β1p、THBS1、SPP1、TIG1、TGM2和结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor, CTGF），而显示纤维化负调节因子骨形态发生蛋白7（Bone morphogenic protein 7, BMP7）的减少。槟榔碱刺激的原代成纤维细胞过表达IL-2、IL-6和IL-21，但下调TGF-β。另一项研究发现，TGF-β由槟榔碱在角质形成细胞中诱导，但在人牙龈成纤维细胞中不诱导，表明角质形成细胞可能是OSF中TGF-β的主要来源。进一步的研究揭示，角质形成细胞通过αvβ6整合素表达分泌TGF-β。
在胶原代谢的介质中，TGF-β1可以调节肌成纤维细胞活化以及胶原酶和金属蛋白酶抑制剂的表达，是槟榔相关OSF中最突出和最显著的因素。TGF-β是增加胶原产生和减少基质降解途径的主要触发因子。TGF-β1信号的激活也介导了miR-21的升高，而miR-21可以靶向抑制性Smad-7，通过阻断TGF-β1信号的正反馈环来减轻博来霉素诱导的肺纤维化的严重程度。此外，TGF-β的上调和激活在槟榔成分儿茶素、单宁和生物碱介导的Smad-2磷酸化激活中发挥作用。此外，CTGF的过表达促进纤维化活性，从而参与OSF的发病机制。响应ROS的MAPK、c-Jun NH2末端激酶（c-Jun NH(2)-terminal kinase, JNK）、NF-κB通路的激活在槟榔碱刺激的颊黏膜成纤维细胞产生CTGF中起着至关重要的调节作用。TGF-β1在激活素受体样激酶5（Activin receptor-like kinase 5, ALK5）、JNK和MAPK通路的介导下诱导CTGF/CCN2的合成。表没食子儿茶素没食子酸酯反过来可以通过阻断颊黏膜成纤维细胞中JNK和p38 MAPK的磷酸化来完全抑制TGF-β1诱导的CCN2的合成。此外，TGF-β可能通过SMAD依赖（ALK5/SMAD2/3）和SMAD非依赖（Src/EGFR/MEK/ERK）途径以及ROS促进促纤维化PAI-1的表达。其他生长因子和细胞因子，如TNF-α、IGF-1和b-FGF，可能在激活的ALK5、JNK、SMAD和MAPK信号通路的调节下诱导胶原的持续积累。此外，在OSF中发现胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor?1, IGF?1）表达升高，在槟榔碱的刺激下呈现剂量依赖性。胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）的活化对槟榔碱诱导的ZEB1的表达起调节作用。
5. 自身免疫
免疫细胞，包括T细胞、巨噬细胞和肥大细胞，主要存在于OSF的结缔组织中。T细胞和上皮细胞之间的交互作用在OSF的发病机制中起着至关重要的作用。Epi1.2，一种具有促炎和促纤维化作用的独特上皮细胞群，在OSF中过表达。Epi1.2细胞可通过与T细胞的相互作用诱导成纤维细胞的纤维化过程。值得注意的是，牙髓干细胞在大鼠颊黏膜中的局部注射显著减少了胶原沉积并促进了血管再生，同时主要通过调节KRT19+MIF+上皮细胞的数量以及通过OSF动物模型中的上皮-基质交互作用来介导免疫稳态。此外，肌成纤维细胞微引擎上程序性死亡配体1（Programmed death ligand 1, PD-L1）的增加，通过作用于T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1, PD-1）受体，改变了归巢到纤维化区域的CD4+T细胞的表型，将这些细胞从抗纤维化细胞转化为产生IL-17A和TGF-β的促纤维化细胞。
此外，外源性抗原刺激引起的过敏反应可能是黏膜纤维化的一种机制。在OSF患者中检测到几种自身免疫相关抗体，如抗胃壁细胞自身抗体（GPCA）、抗甲状腺微粒体抗体（TMA）、抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（SMA）和抗网状蛋白抗体呈阳性。OSF中也报道了免疫复合物表达增加、血清IgG和IgM水平升高以及血清IgA异常。此外，受损的线粒体转录因子A（Mitochondrial transcription factor A, TFAM） 介导的线粒体损伤抑制了成纤维细胞活化。改变的TFAM诱导转录程序，促进肌成纤维细胞从成纤维细胞过渡，并在TGF-β持续激活的响应下驱动组织纤维化。肾小管特异性敲除TFAM的小鼠出现严重的线粒体损失和能量缺陷、肾纤维化和免疫细胞浸润。TFAM敲除小鼠显示出由线粒体DNA异常包装刺激激活的胞质cGAS-STING DNA传感通路，导致更高水平的促炎细胞因子释放和免疫细胞募集。而STING的消融改善了小鼠模型中的肾纤维化。因此，TFAM隔离mtDNA可以通过调节cGAS-STING通路来限制导致纤维化的炎症。
6. 遗传易感性
许多研究提示遗传易感性和家族史参与了OSF的发病机制和临床表现。人类白细胞抗原（Human leukocyte antigens, HLA）分型显示某些HLA抗原易患OSF。已确定HLA-B51/Cw7和HLA-B62/Cw7单倍型对以及HLA-B76表型的频率增加可提高OSF易感性。OSF中也发现A10、DR3和DR7、HLA-A24、HLA-DRB1 * 11和HLA-DRB3 * 0202/3频率升高，以及HLA-Cw2和HLA-DR1表型频率增加。根据使用寡核苷酸微阵列的一项研究，OSF中共有716个基因上调和149个基因下调。这些基因参与TGF-β信号通路诱导的免疫反应、炎症反应和EMT。OSF患者中这些胶原代谢相关基因的多态性主要与胶原1 A1、胶原1 A2、胶原酶1、赖氨酰氧化酶、TGF-β、胱抑素C和TNF-α相关。OSF的家族性发病在印度和南非也有报道。根据一项OSF家族研究，大多数入组患者携带赖氨酰氧化酶G473A或NAD(P)H醌脱氢酶C609T多态性中的一种，或两者都携带。特别是，携带次要NAD(P)H醌脱氢酶T等位基因的野生型赖氨酰氧化酶GG等位基因在患有OSF的兄弟姐妹中非常普遍。此外，OSF中大多数差异表达基因位于1、2、5、6、7、11和12号染色体上。基因本体分类提示这些基因参与与免疫和防御反应、蛋白质结合和信号转导活性相关的生物过程亚组，与细胞外基质、细胞骨架和细胞膜相关的细胞组分亚组，以及与蛋白质结合、细胞外基质结构成分和信号转导活性相关的分子功能亚组。这些发现为个性化医疗和基于生物标志物的风险分层提供了进一步的途径。迫切需要针对TGF-β1、MMPs调节的ECM平衡和遗传水平的赖氨酰氧化酶的新疗法。
三、 OSF的管理
OSF是一种不可逆的疾病，目前尚无批准的靶向抗纤维化策略用于OSF。治疗的主要重点是缓解体征和症状以提高患者的生活质量，并在一定程度上防止恶性转变。目前OSF的管理主要包括消除病因学因素、口腔健康教育、化学药物治疗、天然化合物、全身补充剂和物理治疗。
1. 危险因素控制
核心干预措施包括停止使用槟榔、吸烟、饮酒和摄入辣椒。应进一步加强口腔健康教育，提高人们对咀嚼BQ或长期使用槟榔潜在风险的认识。对于出现相关临床症状的个体，强烈建议及时到口腔医院进行医疗干预。
2. 化学药物治疗
经小型临床试验验证的OSF化学药物疗法主要包括糖皮质激素、抗纤维化和蛋白水解酶如透明质酸酶和糜蛋白酶，以及外周血管扩张剂如己酮可可碱和异克舒令。特别是，糖皮质激素可以抑制炎症因子的产生，诱导炎症细胞凋亡，阻碍成纤维细胞增殖和胶原沉积，从而发挥抗炎活性和抗纤维化作用。透明质酸酶和糜蛋白酶可以降解ECM成分，如透明质酸和胶原，并阻断胶原形成。外周血管扩张剂改善黏膜血流，减少缺血诱导的胶原积累，并具有抗炎活性。
3. 天然化合物疗法
天然化合物如秋水仙碱、番茄红素、黑姜、芦荟、姜黄素、和厚朴酚和牛蒡子苷元在小型临床试验中，以及蜂蜜和表没食子儿茶素没食子酸酯在细胞模型中，旨在抗纤维化、抗炎、抗氧化和改善缺血状况。
一些天然化合物或中药化合物，如姜黄素、黑姜、芦荟、从牛蒡中提取的牛蒡子苷元、光甘草定、中药丹参提取物（丹参、丹参酮、丹酚酸B）、从当归或川芎中提取的丁烯基苯酞以及积雪草提取物积雪草酸，对OSF发挥抗炎、抗氧化和抗纤维化甚至抗肿瘤作用。例如，加味丹玄口康是在经典方剂桃红四物汤和丹玄口康的基础上，根据中医理论调整和修改而成的方剂，可通过抑制OSF大鼠模型中雄激素受体/真核翻译起始因子5A2信号介导的EMT来抑制OSF的癌变。
4. 营养素
全身补充剂包括维生素A、B、C、D、E、锌和铁对OSF具有治疗潜力。口服维生素A、C、E可以靶向ROS并在OSF中发挥抗氧化作用。此外，维生素B12和D发挥抗炎活性和抗纤维化作用。口服硫酸锌片可用于II期和/或重度OSF的治疗干预。锌是铜的拮抗剂，可以抵消铜相关的赖氨酰氧化酶上调的影响。
5. 物理治疗
OSF的物理治疗包括辅助张口训练、高压氧治疗、激光治疗和手术治疗。辅助张口训练可以改善张口度。高压氧治疗通过促进成纤维细胞凋亡和阻碍成纤维细胞活性、抑制促炎细胞因子、富集组织氧合和抑制ROS，发挥抗炎活性和抗氧化特性。激光治疗（如二极管、KTP 532、ErCr:YSGG激光）可以通过松解纤维带来改善张口度、缓解灼烧感、增加颊部柔韧性。手术治疗（切除纤维条带，植入不同的皮瓣，包括腭瓣、舌瓣、鼻唇沟皮瓣、颈阔肌肌皮瓣等）可以直接切除纤维条带。
总之，OSF的发病机制涉及多因素、多通路，其中胶原代谢失衡是核心。未来的研究和治疗策略需要更加侧重于针对关键分子靶点（如TGF-β、EMT相关因子、特定非编码RNA）的精准干预，并结合多模式综合管理，以期为患者带来更好的临床结局。
