《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasound-Enabled Refreshable Electrochemical Sensors for Cardiac Biomarker Monitoring
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基于超声的刷新式电化学传感器用于心肌肌钙蛋白I的高灵敏检测和持续监测，解决了传统实验室方法依赖抗体和红氧化介质的问题，实现了15分钟内0.031pg/mL-1.5ng/mL的宽动态范围检测。超声可无损刷新传感器，延长使用寿命并支持便携式医疗设备应用。
Mayank Garg|Heng Guo|Myeong Namkoong|Elizabeth Zhanov|Connor Malone|Md Saifur Rahman|Ayse Akcan-Arikan|Limei Tian
德克萨斯A&M大学生物医学工程系及远程健康技术与系统中心，美国德克萨斯州大学城，邮编77843
摘要
心肌肌钙蛋白I（cTnI）是急性心肌梗死的金标准生物标志物，但现有的基于实验室的高灵敏度检测方法需要集中式基础设施、受过培训的人员以及连续检测，这限制了它们在资源有限环境中的实时或连续监测应用。即时检测电化学传感器在快速检测cTnI方面显示出潜力，但由于它们依赖于抗体作为生物识别元件和氧化还原介质溶液，以及一次性使用限制了其实际应用。在这里，我们报道了一种基于超声波的可刷新电化学生物传感器，能够实现敏感、稳定和可重复的cTnI监测。该传感器使用cTnI特异性肽作为生物识别元件，在储存、运输和操作过程中具有更好的稳定性。无标记电化学阻抗谱技术可以量化体液（包括血清和唾液）中cTnI结合引起的阻抗变化，从而实现快速分析和高灵敏度检测，同时利用电渗效应增强检测效果。该传感器能够在15分钟内检测并定量cTnI，动态范围为0.031 pg/mL至1.5 ng/mL。与先前报道的电化学平台和传统的基于实验室的高灵敏度检测方法相比，所提出的传感器在检测限、动态范围和检测时间方面具有更好的分析性能。重要的是，低功率超声波可以有效刷新传感器，去除结合的目标物质而不损坏肽，从而实现持续测量并延长传感器寿命。所展示的灵敏度提升和可刷新性为将这种方法扩展到其他生物标志物奠定了基础，为频繁的分子监测和早期临床干预提供了可能。
引言
心血管疾病（CVD）是全球主要的死亡原因，每年估计导致2000万人死亡。其中，急性心肌梗死（AMI）尤其具有生命威胁性，其临床管理严重依赖于快速可靠的诊断（Thygesen等人，2018年）。心肌肌钙蛋白，特别是心肌肌钙蛋白I（cTnI），因其对心肌损伤的高特异性和敏感性而被认为是金标准生物标志物（Apple等人，2017年；Garg等人，2017年；Wang等人，2020年；Welsh等人，2019年）。AMI的特点是肌钙蛋白水平在数小时至数天内出现特征性升高和/或下降（Thygesen等人，2018年）。即使循环中的cTnI水平仅有轻微升高，也可作为心肌损伤的早期指标，这强调了及时准确量化的必要性，以指导临床决策并改善患者预后。AMI发生后长达4小时内，血清中的心肌肌钙蛋白水平可能无法被检测到，因此需要在患者入院后进行连续检测（Apple等人，2017年；Keller和Hamm，2019年；Keller等人，2011年）。尽管基于实验室的高灵敏度cTnI检测方法推动了AMI的许多临床进展，但这些方法仍存在周转时间长、依赖集中式基础设施以及需要受过培训的人员等局限性（Westermann等人，2017年）。这些限制阻碍了它们在分散式或资源有限环境中的应用，也限制了它们进行实时、频繁或连续监测的能力。
即时检测（POC）生物传感平台作为一种通过敏感检测cTnI来早期诊断AMI的有前景的工具而出现（Szunerits等人，2019年；Thulin等人，2023年；Tu等人，2022年）。这类平台具有便携性、快速检测和减少样本需求的特点，使其适用于医院中的床边监测和紧急护理。已经有许多电化学传感器被报道用于cTnI检测，显示出更高的灵敏度和更短的检测时间。许多这些传感器依赖于抗体作为生物识别元件来提供高灵敏度和特异性（Cen等人，2021年；Das等人，2021年；Feng等人，2021年；Li等人，2024年）。然而，抗体在长期储存、运输和重复使用过程中容易降解（Guo等人，2022年；Li等人，2021b年；Tadepalli等人，2015年；Yin等人，2020年），这给将基于抗体的生物传感器转化为实际临床工具和可穿戴应用带来了重大挑战。这种不稳定性影响了体外和体内cTnI量化的重复性和使用寿命。为了解决这一挑战，人们采用了稳定的生物识别元件，包括适配体（Chekin等人，2018年；Eshlaghi等人，2023年；Li等人，2021a年；Negahdary等人，2017年）、分子印迹聚合物（Ma等人，2017年；Mokhtari等人，2020年）和肽（Wang等人，2016年）来提高传感器的稳定性。然而，这些电化学传感器通常依赖于氧化还原介质溶液（如铁氰化物）来量化cTnI，这限制了它们在实时、原位检测中的应用。此外，在cTnI结合后刷新电化学传感器仍然是一个重大挑战，阻碍了它们的频繁和连续监测。
在这项工作中，我们提出了一种基于超声波的可刷新电化学传感器，能够以高灵敏度、特异性和稳定性检测和量化cTnI。该传感器使用cTnI特异性肽作为稳定的生物识别元件，确保在储存、运输和操作过程中的稳定性。我们采用无标记电化学阻抗谱（EIS）技术来量化体液（包括人血清和唾液）中不同cTnI浓度引起的阻抗变化。由两个交错排列的电极激活的交流电渗（ACEO）效应增强了灵敏度并扩展了动态范围，使得在15分钟内能够量化cTnI浓度，范围从0.031 pg/mL到1.5 ng/mL。与先前报道的电化学传感器相比，该传感器在检测限和检测速度方面具有更好的分析性能。低功率超声波能够刷新传感器而不损坏肽或降低灵敏度。此外，我们还证明该传感器可以制造在柔性基底上，便于与人体曲面集成。
材料
人心肌肌钙蛋白I（cTnI）（重组蛋白）购自Life Diagnostics, Inc.。序列为FYSHFHENWPSC的抗心肌肌钙蛋白肽购自GenScript USA Inc。牛血清白蛋白购自Sigma-Aldrich。白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α购自R&D Systems。C反应蛋白购自Invitrogen。10X PBS购自Gibco。硝酸银、柠檬酸钠、盐酸和氢氧化钠购自Fisher
基于肽的电化学传感器设计
该电化学传感器包含四个电极，包括两个交错排列的工作电极、一个对电极和一个参比电极（图1a）。该四电极装置采用标准微制造工艺制备，包括金薄膜沉积和光刻图案化（详见实验部分）。参比电极的金表面通过电化学沉积涂覆银，然后经过氯化铁处理
结论
总之，我们开发了一种电化学传感器，使用cTnI结合肽作为生物识别元件，实现无标记、无介质的cTnI检测。该传感器在极端pH值和生理温度下可保持稳定数天。ACEO效应增强了cTnI的结合和分析灵敏度，能够在稀释的血清中检测到低至31 fg/mL的cTnI，在人工唾液中检测到低至27 fg/mL的cTnI。重要的是，该传感器可以通过超声波进行重置，
CRediT作者贡献声明
Connor Malone：研究。Myeong Namkoong：研究。Elizabeth Zhanov：数据整理。Mayank Garg：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，正式分析。Heng Guo：研究。Limei Tian：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理，研究，资金获取，概念化。Md Saifur Rahman：研究。Ayse Akcan-Arikan：监督
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：鉴于Limei Tian博士担任副主编的角色，她没有参与本文的同行评审，也无法访问有关其同行评审的信息。本文的编辑过程完全由另一位期刊编辑负责。L.T.和M.G.是与本工作相关的专利申请的发明人
致谢
作者感谢国立卫生研究院（拨款编号：R35GM147568）和国家科学基金会（拨款编号：1648451）的资助。该设备的制造在德克萨斯A&M大学 AggieFab纳米制造设施（RRID: SCR_023639）进行，该设施得到了德克萨斯A&M工程实验站和德克萨斯A&M大学的支持。
