利用与海藻相关的海洋链霉菌（Streptomyces sp. OSs-1）通过农业废弃物生产具有成本效益的酶，以实现纳米技术驱动的工业应用

《Enzyme and Microbial Technology》：Harnessing Seaweed-Associated Marine Streptomyces sp. OSs-1 for Nanotechnology-Driven Cost-Effective Enzyme Production using Agricultural Waste

利用红藻Sarconema sp.分离的耐盐Actinobacteria Streptomyces sp. OSs-1，通过Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化酶共生产条件，发现NaCl浓度（3%）和培养时间（5天）是关键因素，最高获得375.91 U/mL的amylase和294.89 U/mL的protease。采用农业废弃物高梁秸秆替代碳源，结合钠果胶酸、氧化锌纳米颗粒和羟基磷灰石的三重固定化技术，显著提升酶的热稳定性和重复使用性。

　　

Vaishali R. Majithiya | Sangeeta D. Gohel

生物科学系，索拉什特拉大学，拉杰科特，360005，古吉拉特邦，印度

摘要

蛋白酶和淀粉酶是具有工业意义的酶，其生产必须在纯度、生产力和成本效益之间取得平衡。本研究探讨了从古吉拉特邦奥卡（Okha）潮间带分离出的红藻物种与Streptomyces sp. OSs-1共同生产这些酶的过程，包括分离方法、表型和基因特性分析、生长动力学研究、酶的固定化以及统计优化。红藻因能生产卡拉胶且与生物活性微生物群落有重要关联而具有工业价值。Plackett-Burman设计确定了影响酶生产的五个关键因素，随后通过Box-Behnken设计进一步进行了优化。方差分析（ANOVA）证实NaCl浓度和培养时间是影响酶生产的最关键因素（p < 0.05）。在最佳条件下（3% NaCl，5天培养），淀粉酶的最大产量为375.91±23.70 U/mL，蛋白酶的最大产量为294.89±15.07 U/mL）。Pareto图和交互作用图等图形工具验证了这些结果。为了降低生产成本，研究人员探索了农业废弃物作为替代底物的可能性。高粱秸秆作为底物时，酶的共产量最高（淀粉酶：206.87±7.07 U/mL，蛋白酶：315.08±14.14 U/mL），同时细胞质量（0.0043 g/mL）和特定生长率（0.0062 h^-1）也达到最佳水平。使用海藻酸钠、氧化锌纳米颗粒和羟基磷灰石对酶进行固定化后，酶的稳定性和可重复使用性得到提升。其中，海藻酸钠+5%戊二醛组合对蛋白酶的固定效果最佳（316.39 U/g），海藻酸钠+氧化锌纳米颗粒+羟基磷灰石+10%戊二醛组合对蛋白酶的固定效果最佳（298.65 U/g）。固定化酶具有更好的热稳定性和pH稳定性。本研究表明，结合使用农业废弃物底物、先进的固定化技术和纳米技术，可以为从与海藻相关的Streptomyces sp. OSs-1中工业生产酶提供经济高效且可扩展的解决方案。

引言

海藻以其生产多种具有工业价值的化合物而闻名，如琼脂、卡拉胶、藻酸盐、岩藻多糖和色素等[1]。然而，关于与海藻相关的细菌的研究仍然有限[2]。与海藻共生的细菌要么是附生菌，要么是内生菌，它们能产生促进植物生长的物质、群体感应信号分子以及其他对海藻正常形态、发育和生长至关重要的生物活性化合物[3][4]。大多数新型药物化合物都是在海洋环境中发现的[5][6]。从与海藻相关的细菌中提取的天然产物在对抗抗生素耐药性方面显示出良好的效果[7]。奥卡海岸位于印度古吉拉特邦的索拉什特拉地区西北部，是库奇湾和阿拉伯海的交汇处。奥卡海岸的潮间带长度为0.7-0.9公里，主要由岩石和沙子构成[8][9]。据报道，奥卡海水的年平均温度为20至33.6°C，pH值为8.0至8.37，溶解氧含量为6.4至8.2 ppm，盐度为26.89至45.44 ppt[10]。迄今为止，印度古吉拉特邦的沿海地区已经发现了多种动植物物种。然而，针对古吉拉特邦沿海地区，尤其是索拉什特拉地区的微生物多样性的研究仍然较少。尽管与海藻相关的细菌在生态和工业上具有重要意义，但关于索拉什特拉海岸线附近海洋放线菌的研究仍然不足。此外，目前还没有研究报道从这些分离株中同时生产多种工业酶或利用农业废弃物底物的情况[4][11][12]。因此，本研究选择了索拉什特拉地区的奥卡海岸来研究与海藻相关的海洋放线菌。

放线菌能够在恶劣环境中生存和生长，并以其多样的生物活性代谢产物的产生而闻名[13][14]。因此，从海洋放线菌中提取的酶在碱性和盐性条件下具有更好的功能，这些特性正是洗涤剂和食品工业所需要的[15][16]。为了实现最佳的酶生产效果，优化培养条件非常重要，因为它们会显著影响细胞生长率和酶的分泌[16]。为了系统地提高酶产量，采用了统计优化方法来确定和微调影响酶产量的关键物理化学参数。这一策略使得利用海洋放线菌菌株稳定共生产淀粉酶和蛋白酶的最佳条件成为可能[17][18]。

在当今全球化世界中，每年会产生数百万吨农业废弃物以满足不断增长的人口需求。农业废弃物主要包括作物秸秆和牲畜粪便[19]。利用这些材料生产有价值的产品有助于实现资源回收，减少污染，并为酶生产提供可行的替代底物[16]。从商业角度来看，胞外蛋白酶和淀粉酶是最重要的酶，主要应用于食品、皮革、乳制品、酿造、纺织和制药等行业[16]。蛋白酶占全球酶市场的约60%[20]，而淀粉酶约占30%[7]。古吉拉特邦的经济发展与农业密切相关，该邦约51.8%的就业岗位与农业相关。古吉拉特邦的主要经济作物包括棉花、花生、烟草和孜然；卡蒂亚瓦尔（Kathiawar）地区的主要农作物还包括棉花、甘蔗、高粱、小米、小麦、花生和蓖麻（https://www.agrifarming.in）。农业废弃物，尤其是牲畜粪便和作物秸秆，富含蛋白质、碳水化合物、脂肪和矿物质。因此，利用这些废弃物生产高附加值产品可以提高产品质量并降低生产成本[19]。

近年来，固定化技术已成为提高酶性能（包括稳定性和可重复使用性）的有效方法[21]。用于酶固定的支持基质在酶的稳定性中起着关键作用。为了实现高效的固定，广泛使用海藻酸钠来固定B. brevis产生的蛋白酶[22]和B. subtilis产生的淀粉酶[23]。此外，添加交联剂、壳聚糖以及TiO₂和SiO₂等纳米颗粒也能增强酶的固定效果[24][25]。因此，在本研究中，通过海藻酸钠、氧化锌纳米颗粒和羟基磷灰石与戊二醛的组合实现了淀粉酶和蛋白酶的固定化。本研究的重要性在于，它展示了利用标准化学物质和农业废弃物同时生产多种酶的方法，以及固定化粗酶对多个工业领域的潜在益处。

本研究的目的是从奥卡海岸地区收集的海藻物种中分离出嗜卤放线菌，并评估所鉴定菌株Streptomyces sp. OSs-1的生物催化潜力。该菌株能分泌蛋白酶、淀粉酶和L-天冬酰胺酶。研究的具体目标是利用单一菌株和单一培养基实现蛋白酶和淀粉酶的共生产，评估使用农业废弃物作为替代底物的效果，并通过固定化粗酶进一步提高其工业应用价值。

部分内容摘录

分离、鉴定、表型和基因型特征分析

海藻样本 sp.（门：红藻门）是从印度古吉拉特邦奥卡地区的潮间带采集的（纬度：22°28′49.73″；经度：69°4′48.79″）。样本被放入无菌采样容器中并立即送往实验室。用于分离与海藻相关的新型放线菌菌株的策略包括系列稀释和平板接种技术。简要来说，1克海藻用无菌人工海水彻底清洗后...

Streptomyces sp. OSs-1菌株的特征分析

古吉拉特邦位于印度西海岸，拥有长达1600公里的海岸线，孕育了丰富的海藻物种多样性。仅库奇湾就记录了151种海藻，其中包括44种绿藻（Chlorophyta）、31种褐藻（Ochrophyta）和76种红藻（Rhodophyta）[3][36]。在红藻中，Sarconema>因其在卡拉胶生产方面的潜力而具有特殊的工业价值[37]。

结论

本研究成功证明了与海藻共生的Streptomyces sp. OSs-1能够同时生产淀粉酶和蛋白酶。这种共生关系特别值得关注，因为与海藻相关的微生物是新型酶和生物活性化合物的丰富且未充分开发的来源，这些微生物通常适应了独特的海洋环境。通过Plackett-Burman和Box-Behnken设计进行的优化确定了影响酶共生产的关键因素，其中NaCl浓度...

作者声明

所有作者均确认已审阅并批准了提交的手稿最终版本，题为“利用农业废弃物通过海洋相关Streptomyces sp. OSs-1进行纳米技术驱动的高效酶生产”。我们保证本文为作者的原创作品，未曾在其他地方发表，也未被其他机构考虑发表。

CRediT作者贡献声明

Sangeeta D. Gohel：撰写——审稿与编辑、监督、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构思。 Majithiya Vaishali：撰写——初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。

致谢

作者Vaishali Majithiya感谢印度古吉拉特邦的SHODH（高质量研究发展计划）在2020-2021年提供的研究奖学金。作者还感谢UGC（大学拨款委员会）-CAS（高级研究中心）和DST-FIST项目、UGC-BSR（基础科学研究）启动基金项目（项目编号F.30-101/2015；2015-2017年）以及DST-SERB（新德里）的支持（项目编号ECR/2016/000928；2017-2020年）的资助。