《International Journal of Biological Macromolecules》：Advancing chloroplast bioengineering: Innovations, regulatory challenges, and translational pathways for sustainable agriculture
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提升作物抗逆性及生物制造效能的叶绿体生物工程框架研究|
马尔莱沙姆·布尔（Mallesham Bulle）、姆德·梅扎努尔·拉赫曼（Md Mezanur Rahman）、斯里尼瓦斯·科塔（Srinivas Kota）、姆德·罗比乌尔·伊斯兰（Md Robyul Islam）、桑吉达·苏尔塔娜·凯亚（Sanjida Sultana Keya）、萨达南丹姆·阿巴加尼（Sadanandam Abbagani）、普卢古尔塔·巴拉德瓦贾·基尔蒂（Pulugurtha Bharadwaja Kirti）
印度特伦甘纳邦海得拉巴市拉詹德拉纳加尔（Rajendranagar），PJTS农业大学校区，农业生物技术基金会（Agri Biotech Foundation），邮编500030
摘要
日益严重的气候不稳定和不断增长的全球食品需求迫切需要开发出具有韧性的作物系统，这些系统应以精确、可预测且能够快速应用的基因创新为基础。叶绿体生物工程已成为一种前沿策略，它具有独特的优势：叶绿体具有独特的质体结构、明确的拷贝数以及主要通过母系遗传传递的特性。近年来，叶绿体转化和碱基编辑技术的进步使得能够在多种植物中高保真地引入光合作用相关、渗透保护以及氧化还原调节的基因通路。在受控环境和接近田间的试验中，结果表明，经过叶绿体工程改造的代谢模块能够增强二氧化碳的吸收能力，在高温和干旱胁迫下稳定光化学反应，并提高植物的渗透缓冲能力。除了改善作物性状外，叶绿体还作为高产力的生产器官，能够积累足够量的口服或黏膜生物制剂，从而减少对冷链物流的依赖。然而，诸如物种间的抗性差异、实现同质叶绿体的漫长时间线以及当前叶绿体生物制造工艺的可扩展性有限等问题，仍然限制了其在农业和生物制药领域的广泛应用。为克服这些障碍，我们提出了一个标准化的、可实证验证的框架，该框架整合了优化的转化流程、定量性状评估、多地点田间验证以及技术经济分析。该框架体现了长期管理的原则，包括无标记选择、主动的抗性管理以及符合FAIR原则的数据透明度，并特别关注资源匮乏地区的公平获取途径。总体而言，叶绿体工程为在加速气候变化的压力下重塑作物韧性、实现可持续生物生产和提高全球生物制品的可及性提供了坚实的机制基础。
引言
预计到2050年全球人口将增至97亿，这凸显了迫切需要采取变革性策略，以在不进一步破坏环境的前提下可持续地提高粮食产量[1]。尽管通过传统农学和分子育种取得了显著进展，但这些方法仍不足以缩小作物生产力与全球需求之间的差距[2]。COVID-19大流行期间，现有农业模式的脆弱性得到了充分暴露，全球供应链的中断凸显了开发具有抵御未来危机能力的韧性及可持续食品系统的必要性[3]。植物基因工程为农业转型提供了直接途径，能够精准提升作物的产量、抗逆性和营养价值[4]。虽然大多数研究集中在核基因组上，但越来越多的关注转向了叶绿体——这一兼具能量转化和生物合成功能的细胞器，其原核起源为基因工程带来了独特的机会[5][6]。叶绿体的紧凑结构和多倍体特性允许高拷贝数的转基因插入，通过同源重组实现靶向整合，并通过多顺反子表达协调各种酶和生物分子的合成，这些对于光合作用、代谢和应激反应至关重要[5][7]。此外，大多数作物中叶绿体的主要母系遗传特性限制了转基因通过花粉传播的风险[8][9]。综上所述，叶绿体工程成为一个强大的平台，结合了高遗传稳定性和表达效率，同时具备生态安全性，为下一代作物改良提供了有力支持。
基于这一基础，叶绿体转化技术的多功能性正在被应用于从基础的光合作用途径重构到复杂的抗逆性调控因子的开发，以及通过分子农业系统生产高价值生物制剂等多个领域[5][10][11]。推动这些雄心勃勃的努力的是近年来在转基因传递和仅蛋白质编辑技术方面的进展（见图1和表1），这些技术扩大了可转化作物的范围，并实现了在核苷酸水平上的精确叶绿体修饰[6]。然而，尽管已有近四十年的发展，叶绿体工程仍未实现广泛的应用，主要受到物种转化抗性、实现同质叶绿体的缓慢进程以及劳动密集型下游处理流程的阻碍[5][9][12]。在这篇综述中，我们回顾了叶绿体工程从概念基础到新兴前沿的发展历程。首先，我们将叶绿体描述为一个优化的生物工程平台，强调了其基因组结构、 compartmentalized 组织和表达机制如何实现高效的基因表达和剂量控制。接着，我们分析了主要的技术障碍，尤其是转基因传递和稳定同质叶绿体的实现，并探讨了如何通过系统生物学指导的预测性设计推动该领域超越经验迭代阶段的发展。在此基础上，我们探讨了叶绿体工程在光合作用重构、气候适应性和分子农业中的应用。最后，我们概述了实现商业化应用的路径，强调了监管和生物安全框架以及定量指标（如转化效率、叶绿体拷贝数和蛋白质产量）作为未来进展的衡量标准。
叶绿体结构：大自然优化的生物工程平台
叶绿体是植物细胞中的光合作用和代谢引擎，起源于一次原始的内共生事件，当时一个真核宿主吸收了一个蓝细菌祖先[13]。随着进化过程中基因向细胞核的广泛转移，内共生体的基因组缩小为一个约120–180 kb的质体，其中编码了大约100个关键基因[14][15]。这个高度保守的四部分基因组由大片段和小片段组成，两者之间通过重复的倒位序列分隔
针对叶绿体的转化技术：克服细胞器层面的障碍
尽管叶绿体具有有利的遗传结构和多样的表达工具，但其基因组工程仍受到诸多技术障碍的限制。尽管叶绿体转化能够通过同源重组实现转基因的稳定表达、高蛋白产量以及通过母系遗传带来的内在生物安全性[6]，但近四十年的努力仅在一些少数物种中成功建立了稳定的转基因系统。三个相互关联的挑战依然存在：
系统生物学与多组学在叶绿体工程中的应用
叶绿体工程正从经验驱动的研究向数据驱动的科学方向发展。借助高通量组学和计算建模，设计-构建-测试-学习（DBTL）框架开始规范叶绿体性能的迭代优化[86]。虽然迄今为止的大部分研究仍集中在Nicotiana tabacum、Arabidopsis thaliana和Lactuca sativa等模式生物上，但这一转变标志着向定量分析的实质性迈进用于光合作用和气候适应性的叶绿体合成生物学
叶绿体转化技术的成熟使得该领域从概念验证阶段发展到实际应用于作物代谢重编程。随着可靠的DNA传递平台、生物轰击技术和聚乙烯二醇（PEG）介导的原生质体摄取方法的建立，以及通过同源重组实现靶向整合，叶绿体生物技术越来越多地被用于改造作物代谢，以提高光合作用效率、增强抗逆性并生产高价值生物制品精准医学与叶绿体衍生治疗药物
传统的生物制药生产依赖于昂贵的发酵罐、复杂的纯化步骤和冷链物流，这限制了全球范围内的应用，尤其是在低收入和中等收入地区[133][134]。叶绿体工程提供了一种替代方案，可以在生菜等可食用植物中生产疫苗抗原和治疗性生物制剂，并以冻干细胞的形式在常温下长期保存[133]（见图3）。该系统利用了
从实验室到市场的商业化转化
在过去十年中，叶绿体生物技术已从概念验证研究发展到在农业和生物制造领域的实际应用。早期报告显示重组蛋白的积累量可达总干重的50–70%，但田间数据表明产量受产品类型和环境条件的显著影响[12][148]。田间试验确立了关键基准：在开放田间条件下，表达细菌cello-biohydrolase II（Cel6A）的转基因烟草保持了约20%的总干重监管环境与叶绿体特异性生物安全性
叶绿体转化通过母系遗传提供了内在的生物安全性，因为叶绿体主要通过胚珠传递，大大减少了花粉介导的基因流动到野生亲本的风险[161]。父系基因的泄漏极为罕见（<10^-5），但会因物种和环境条件（如高温期间的花粉发育）而变化[8][162]。这一总体有效的但并不完美的屏障支持采用多层次的安全措施，包括无标记的基因构建和遗传全球影响评估与社会变革
由于光合作用对农业产量的直接影响，叶绿体工程的真正效果必须通过多地点、多季节的田间试验来评估，这些试验使用透明的、预先注册的指标来衡量产量稳定性、资源利用效率和温室气体排放强度。初步的田间研究表明产量有所提高，但这些结果仍显著依赖于环境因素，需要通过基因型-环境分析及稳定性指数进行验证2050年的战略路线图与愿景：叶绿体工程作为下一代农业的基石
要将叶绿体工程从概念验证阶段推进到主要作物的实际应用，需要定量设计原则、标准化方法以及公平的获取途径。未来二十五年可以划分为三个协调发展的阶段，将实验成果转化为经过验证、社会认可的技术。结论
叶绿体工程正处于一个关键时刻，它将基础植物生物学转化为应用于农业、生物制造和健康领域的创新。从基于环境条件的光合作用增强到精准的仅蛋白质编辑，再到高水平的代谢产物和蛋白质生产，这些突破标志着从概念验证向实际应用的转变。然而，仍存在一些关键挑战，尤其是谷物作物的转化效率较低、实现同质叶绿体的过程漫长
马尔莱沙姆·布尔（Mallesham Bulle）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据整理、概念构思。姆德·梅扎努尔·拉赫曼（Md Mezanur Rahman）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化。斯里尼瓦斯·科塔（Srinivas Kota）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。姆德·罗比乌尔·伊斯兰（Md Robyul Islam）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。桑吉达·苏尔塔娜·凯亚（Sanjida Sultana Keya）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。萨达南丹姆·阿巴加尼（Sadanandam Abbagani）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。
作者们未获得这项工作的任何特定资助。
PBK担任该期刊的执行编辑，但未参与本手稿的同行评审或编辑决策过程。其余作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们衷心感谢叶绿体工程领域内的杰出科学家们，由于篇幅限制，我们未能充分讨论或引用他们的贡献。
