《Frontiers in Pharmacology》：Effect of the antifungal drug ciclopirox on the inhibition of HMGA2-mediated oncogenic capacity in ACHN renal cell carcinoma
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本综述研究抗真菌药物环吡酮胺（Ciclopirox olamine, CPX）在肾细胞癌（RCC）中的抗癌作用及其分子机制。研究发现，CPX通过下调HMGA2蛋白表达，抑制TGF-β/Smads与E2F1/Cyclin D1/CDK6信号通路，从而阻断细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制上皮-间质转化（EMT），并显著降低肾癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。体内实验进一步证实CPX能有效抑制肿瘤生长。该研究为CPX作为一种靶向HMGA2的抗肾癌药物再利用提供了新的实验与理论依据。
1 引言
肾细胞癌（Renal cell carcinoma, RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率在过去几十年中持续上升。尽管靶向药物如索拉非尼（Sorafenib）、舒尼替尼（Sunitinib）和替西罗莫司（Temsirolimus）等为治疗带来了新选择，但晚期肾癌的预后仍然不佳，亟需探索新的治疗策略。
环吡酮胺（Ciclopirox olamine, CPX）是一种已过专利期的广谱抗真菌药物。近年来的研究揭示，CPX在多种肿瘤中表现出抗癌活性，例如乳腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤等。其抗癌机制涉及破坏细胞内铁稳态、抑制核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase, RR），导致DNA损伤和细胞周期阻滞。然而，CPX对肾癌的作用及其机制尚未见报道。
HMGA2（Human high-mobility group A2）基因编码一种非组蛋白染色质蛋白，在细胞周期调控、凋亡诱导、DNA损伤修复以及上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）过程中起关键作用。HMGA2的高表达与肿瘤进展、不良预后及治疗反应差密切相关，被认为是一个潜在的治疗靶点。先前的研究表明，下调HMGA2表达能显著抑制肾癌细胞的增殖和侵袭能力，并促进其凋亡。
本研究发现，CPX能有效抑制肾癌细胞系ACHN的生长，并在体内外实验中展现出抗肿瘤潜力。进一步机制研究表明，CPX通过下调HMGA2表达，影响了关键的致癌信号通路。
2 材料与方法
本研究使用人肾腺癌细胞系ACHN进行实验。CPX和阳性对照药物索拉非尼均购自TargetMol公司。实验方法包括：
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CCK8细胞增殖实验：用于测定CPX对ACHN细胞的半数抑制浓度（IC50）。
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克隆形成实验：评估CPX对细胞长期增殖能力的影响。
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Transwell侵袭实验与划痕愈合实验：分别检测CPX对细胞侵袭和迁移能力的影响。
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流式细胞术：使用PI单染法分析细胞周期分布，使用Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡。
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裸鼠异种移植瘤模型：建立ACHN细胞皮下移植瘤模型，评估CPX在体内的抗肿瘤效果。
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蛋白质印迹（Western blotting）与实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）：检测HMGA2、E2F1、Cyclin D1、CDK6、E-cadherin、N-cadherin、Smad2、Smad3、TGF-β RII及Snail等分子的mRNA和蛋白表达水平。
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苏木精-伊红（H&E）染色：对肿瘤组织进行病理学分析。
所有数据分析均使用SPSS软件，P ≤ 0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 CPX抑制人肾癌ACHN细胞的生长与增殖
CPX的化学结构如图1A所示。CCK8实验结果显示，CPX处理72小时后，随着药物浓度升高，ACHN细胞的OD值逐渐下降，抑制率升高（P < 0.001），计算得出IC50为5.407 μM（）。克隆形成实验证实，与生理盐水对照组相比，CPX和索拉非尼阳性对照组均能显著抑制ACHN细胞增殖，且高浓度CPX的抑制效果更强。
3.2 CPX抑制人肾癌ACHN细胞的迁移与侵袭
划痕愈合实验表明，与空白对照组相比，CPX和索拉非尼处理组的细胞迁移能力显著减弱，且高浓度CPX（5.4 μM）的抑制作用更明显（P < 0.001）。Transwell侵袭实验也得到一致结果，CPX能显著减少穿透基质胶的细胞数量，抑制细胞的侵袭能力（）。
3.3 CPX通过抑制G1/S期转换阻滞肾癌ACHN细胞周期
流式细胞术分析显示，与空白对照组相比，CPX和索拉非尼处理组的细胞在G0/G1期的比例显著增加（P < 0.001），表明CPX能将细胞周期阻滞在G1期（）。
3.4 CPX在体外实验中诱导肾癌ACHN细胞凋亡
Annexin-V FITC/PI双染流式细胞术检测显示，与空白对照组相比，CPX处理组和阳性对照组的细胞凋亡率显著升高，且呈浓度依赖性增加（P < 0.001）（）。
3.5 CPX给药抑制小鼠异种移植瘤的生长
建立ACHN细胞裸鼠皮下移植瘤模型。当肿瘤体积约达200 mm3时，将动物随机分为四组：空白对照组、低剂量CPX组（10 mg/kg）、高剂量CPX组（30 mg/kg）和索拉非尼阳性对照组（20 mg/kg）。结果显示，与对照组相比，CPX处理组的肿瘤体积和重量均显著减小（P < 0.001），且小鼠平均体重在各组间无显著差异，表明CPX在体内能有效抑制肿瘤生长且无明显毒性（）。
3.6 CPX通过下调HMGA2蛋白表达水平抑制TGF-β/Smads信号通路，从而降低肾癌ACHN细胞的上皮-间质转化（EMT）
qRT-PCR和Western blot实验结果显示，与空白对照组相比，CPX处理组中N-cadherin、TGF-β R II、Smad2、Smad3和Snail的mRNA及蛋白表达水平均显著降低，而上皮标志物E-cadherin的表达显著升高（P < 0.001）（）。这表明CPX通过抑制HMGA2表达，减少了EMT关键转录因子Snail的产生，从而抑制了肾癌细胞的EMT过程。
3.7 CPX通过下调HMGA2蛋白水平抑制E2F1/Cyclin D1/CDK6信号通路，导致肾癌ACHN细胞周期紊乱
实验发现，CPX能显著抑制ACHN细胞中HMGA2的mRNA和蛋白表达。进一步检测发现，与对照组相比，CPX处理组中E2F1、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）的mRNA和蛋白表达均显著下调（P < 0.001）（）。这表明CPX通过下调HMGA2，进而抑制转录因子E2F1的水平，导致Cyclin D1和CDK6表达降低，最终引起肾癌细胞周期紊乱。
4 讨论
肾细胞癌的治疗仍然面临挑战，尤其是对靶向药物产生耐药性的问题。本研究发现，传统抗真菌药物CPX对肾癌细胞具有多方面的抑制作用。其抗癌机制与HMGA2这一关键致癌因子密切相关。HMGA2的高表达与肾癌的TNM分期和淋巴结转移相关，是疾病进展和不良预后的指标。本研究首次揭示了CPX在肾癌中通过靶向HMGA2发挥作用的机制：CPX通过下调HMGA2，一方面抑制了TGF-β/Smads信号通路，降低了Snail表达，从而逆转了EMT过程，抑制了癌细胞的迁移和侵袭；另一方面，抑制了E2F1/Cyclin D1/CDK6通路，导致细胞周期在G1期阻滞并诱导细胞凋亡，从而抑制了癌细胞的增殖。体内实验进一步证实了CPX的抑瘤效果。CPX的多靶点作用特性（如铁螯合）可能使其对肿瘤细胞具有选择性毒性。然而，本研究仅使用了ACHN一种肾癌细胞系，未来需要在其他肾癌细胞系（如786-O、769-P）中进行验证。此外，HMGA2调控Snail表达的具体机制以及CPX对肿瘤微环境中TGF-β细胞因子分泌的影响，仍需进一步探索。计划在后续研究中通过免疫组织化学（IHC）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，更全面地验证CPX的作用机制。
5 结论
本研究揭示了CPX通过靶向HMGA2，抑制TGF-β/Smads和E2F1/Cyclin D1/CDK6信号通路，从而在体外和体内抑制肾细胞癌生长、迁移、侵袭并诱导细胞周期阻滞和凋亡的分子机制。这些发现为将已上市的抗真菌药物CPX重新定位（Repurposing）为一种靶向HMGA2的潜在抗肾癌药物提供了新的实验证据和理论依据。尽管结果令人鼓舞，但研究也存在局限性，例如仅使用了一种细胞系。未来需要探索CPX在其他肾癌细胞系中的效果，并优化给药方案，以推动其临床转化应用。
