《BMC Methods》：On-lamella dual-axis cryo-electron tomography and modelling of lamella stability
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本综述聚焦于冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削细胞薄片进行冷冻电子断层成像（cryo-ET）的技术优化。针对传统矩形铣削模式限制倾斜角度、阻碍双轴成像及薄片易碎裂等问题，研究提出了一种创新的梯形铣削策略，结合有限元机械模拟来优化设计。该方法成功实现了常规化的双轴cryo-ET，通过补全缺失楔信息，显著提升了断层图的可解释性和三维分割质量。同时，机械模拟揭示了应力集中区域，为设计具有更高机械稳定性的铣削图案提供了理论预测工具。这些改进共同提高了cryo-ET的数据质量与通量，并为基于深度学习的缺失楔恢复方法提供了更佳的训练数据集。
摘要
冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削的细胞薄片结合冷冻电子断层成像（cryo-ET），能够在近原生状态下以纳米级分辨率可视化细胞的三维结构。然而，通常采用的矩形铣削模式限制了可及的倾斜角度范围，从而无法进行双轴断层成像。此外，冷冻薄片必须保持与细胞主体的机械连接，在制备和转移到冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）过程中容易断裂，降低了实验通量。
本研究开发了一种cryo-FIB梯形铣削策略，该策略通过使样品台加载时倾斜轴垂直于铣削方向，从而实现了双轴cryo-ET。研究采集并比较了双轴和单轴cryo-ET数据集，其中包括使用基于深度学习的缺失楔恢复方法处理的单轴断层图。为应对薄片稳定性问题，研究进行了基于有限元的机械模拟，以计算不同薄片几何形状和铣削设计中冯·米塞斯（von Mises）应力的积聚情况。
结果表明，与传统的单轴断层成像以及经过深度学习缺失楔恢复处理的单轴断层图相比，双轴cryo-ET提供了额外的三维信息，从而改善了断层图的可解释性和分割质量。此外，机械模拟识别了冷冻薄片内的应力累积和易断裂区域，使得能够合理设计具有更高机械稳定性的铣削图案。
综上所述，梯形cryo-FIB铣削策略实现了细胞薄片的常规化双轴cryo-ET，提高了三维信息含量和分割质量。同时，基于有限元的力学框架为优化薄片设计和稳定性提供了一个预测工具。这些方法共同提高了cryo-ET数据质量和通量，并为进一步发展基于深度学习的恢复方法提供了宝贵的训练数据集。
引言
冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削是制备用于冷冻电子断层成像（cryo-ET）研究的玻璃化生物样品电子透明薄片的首选方法。cryo-ET通常沿单一倾斜轴进行剂量对称的方式采集倾转系列。由于薄片具有平板几何形状，倾转通常被限制在±60°范围内，这导致了傅里叶空间中的缺失楔信息。这种限制使得断层图具有各向异性分辨率，并且沿Z轴的特征被拉长。尽管已经开发了多种方法，包括深度学习缺失楔恢复算法来填补傅里叶空间中的缺失楔信息，但这些方法尚未在细胞薄片双轴cryo-ET上进行评估。此外，由于细胞内生物结构的高密度和复杂性，通过计算机恢复详细的三维信息具有挑战性。
本研究旨在探索在cryo-FIB铣削制备的薄片上实现双轴设置的潜力。此前，双轴透射和扫描透射电子断层成像已应用于室温样品和玻璃化样品。为了在不卸载样品的情况下实现样品台旋转，已开发出双轴样品台和样品杆，并可集成到现代TEM系统中，如Titan Krios（Thermo Fisher Scientific）和CRYOARM（JEOL）。Krios单轴样品杆在倾斜时的稳定性略高于双轴样品杆，但通过使用倾斜时的回差方法，可以有效最小化双轴设计中复杂几何结构和独立运动部件带来的样品偏移影响。
双轴ET可以部分补全缺失楔信息，有助于三维解释复杂的膜结构并提高分割准确性。然而，目前使用的铣削方法通常采用矩形图案，当倾斜轴垂直于铣削方向时，仅支持单轴倾转系列采集，这限制或阻碍了双轴断层成像的应用。此外，使用矩形图案制备的薄片必须垂直于倾斜轴方向加载到显微镜样品台上，这一过程在技术上具有挑战性。
随着自动化程度的提高，cryo-FIB铣削的通量正在稳步增加。然而，在铣削过程中，薄片可能发生不期望的变形或倾斜，这主要是由于支撑膜的压缩以及铣削过程中释放的压缩力造成的。通常，会在细胞主体中设置应力释放切口（也称为微膨胀缝）来释放垂直于铣削方向施加在薄片上的侧向力，从而防止薄片倾斜或变形。然而，薄片几何形状和应力点的物理机制仍有待研究，以指导更好的铣削几何形状设计，从而增强薄片稳定性并提高通量。
本研究展示了一种梯形铣削图案，使得能够在商用显微镜上对薄片进行双轴cryo-ET。双轴断层图相较于单轴断层图增加了三维信息，有助于自动分割，并可作为改进深度学习缺失楔恢复方法的训练数据。此外，本研究通过线弹性理论和有限元模拟，深入了解了薄片中的物理力和应力分布，并为铣削设计的改进提出了建议。研究表明，最危险的断裂点位于薄片与细胞主体之间的连接处，而圆角设计可能会降低这种风险。但是，如果连接处的材料过多，例如圆角半径过大或应力释放切口与细胞主体之间的距离过远，则反而会产生不利影响。
材料与方法
细胞的速冻处理：将VeroE6细胞接种到Quantifoil SiO2R1.2/20 200 Au网格上，使用Leica GP2 plunge freezer在80%腔体湿度和37°C腔体温度下进行速冻。
贴壁细胞的cryo-FIB铣削：将网格夹入ThermoFisher CryoFIB AutoGrids并装载到Aquilos 2 cryo-FIBSEM中。在MAPS中选择目标细胞并进行对中调整后，手动使用梯形铣削图案对薄片进行铣削。
薄片双轴冷冻电子断层成像采集：使用配备BioQuantum?LS能量过滤器（狭缝宽度15 eV）和K3直接电子探测器（Gatan）的Titan Krios透射电子显微镜（300 keV），通过SerialEM软件进行cryo-ET数据采集。双轴断层成像使用Krios G1的双轴样品台完成，该样品台支持约90°的旋转。A轴和B轴单轴倾转系列在33,000倍放大倍数、像素尺寸2.589 ?/像素、欠焦-4 μm条件下采集，每个投影的电子剂量约为1.5 e?/?2。采用剂量对称采集方案，A轴倾转范围为+68°至-52°，起始角8°；B轴倾转范围为+60°至-60°，起始角0°，以3°为增量步长。倾转系列使用PACE tomo并行采集。
双轴断层图重建：使用IMOD软件进行倾转系列的对齐和断层图重建，采用加权反投影算法并结合SIRT-like滤波。在断层图重建前，使用IMOD进行了二维衬度传递函数（CTF）校正和剂量加权滤波。两个断层图在IMOD中使用重叠块（400 × 400 × 200像素）进行合并。
有限元模拟：使用开源软件框架Dolfinx求解线性弹性平衡方程，将玻璃化细胞模拟为具有杨氏模量8 GPa和泊松比0.15的各向同性弹性材料。
结果
采用梯形铣削图案后，我们的数据显示，梯形铣削图案可以防止细胞主体在极端倾角下遮挡薄片部分区域，从而使得在大约80%的薄片区域上实现双轴断层成像。
研究表明，双轴断层图与单轴断层图相比，提供了额外的三维信息，这提高了断层图的解释性和分割质量。
与基于深度学习的方法（如IsoNet和DeepDeWedge）训练于单轴数据相比，这些方法无法完全恢复双轴数据中存在的、垂直于倾斜轴的特征。
力学模拟结果显示，对于T型连接，在连接处观察到应力集中，这是由于尖锐的接触角造成的，应力高达30 MPa，而大部分其余区域应力为0.1–15 MPa。
相比之下，斜坡阶梯连接和Y型连接将应力集中在薄片本身，范围在20到37 MPa之间。连接处的应力由于抑制了屈曲而显著降低。
模拟结果表明，将应力释放切口更靠近薄片放置（例如三角形或V形切口）比垂直应力释放切口更能减少薄片中的冯·米塞斯应力。
通过模拟具有不同曲率半径的连接处发现，使用圆角连接可以避免锐角处的应力集中，但当圆角半径过大时，增加的材料量会产生不利影响，应力存在一个最小值点。
讨论
cryo-FIB开辟了在三维和分子分辨率上研究未受干扰的玻璃化细胞环境的途径。双轴cryo-ET包含了额外的三维信息，并提供了分辨率各向异性更低的断层图。这有助于数据解释、三维分割以及直接可视化小蛋白复合物和丝状结构，这些结构的方向可能因倾斜轴而遭受信息损失。
本研究建立的cryo-FIB梯形铣削图案能够制备适用于双轴cryo-ET的冷冻薄片。结合PACE tomo等并行采集技术，双轴倾转系列采集时间不再是主要限制因素。我们的数据表明，将电子剂量分配到两个正交取向的倾转系列中，仍能通过块跟踪实现对齐，并重建两个断层图。我们没有观察到由于显微照片中电子剂量降低而导致的配准误差显著增加。利用MemBrain等工具进行的无监督三维分割表明，双轴cryo-ET在三维细胞器结构方面提供了更多信息，优于单轴cryo-ET。与基于深度学习的缺失楔恢复方法比较发现，这些恢复方法并不完全，且在一定程度上不准确。为了克服这一局限性，我们建议利用双轴断层图作为训练数据集，以提高基于深度学习的缺失楔恢复方法的预测准确性。双轴cryo-ET的主要限制来自于第二个倾转系列积累的电子剂量。
尽管实现了自动化，cryo-FIB薄片制备仍然是原位cryo-ET的主要瓶颈。由于侧向压力在铣削过程中释放，薄片可能会弯曲或开裂。本研究通过理论建模来识别薄片上的应力点。有限元模拟证实了应力释放切口对矩形几何形状中热皱缩的保护作用。对于Y型连接，垂直应力释放切口似乎作用较小，因为该几何形状的薄片承受的冯·米塞斯应力高于主体其他部分。模拟表明，对于Y型连接，矩形几何形状在应力减少方面并非最优，而三角形或V形应力释放切口应更有效。实验证明这些图案可以成功铣削并制备出适用于cryo-TEM成像的薄片。
圆角设计是避免尖角处应力集中的一种策略。我们的模拟证实了这一点，但也表明保留过多材料会再次产生不利结果。玻璃冰的热膨胀系数高于常用的EM网格材料（如非晶碳和二氧化硅），这种不匹配会产生高应力。因此，选择与玻璃冰热膨胀系数相近的基底（如金）是最大限度地减少热应力的合理策略。未来，逆问题理论和合理设计可用于自动预测新的有利设计。然而，圆边设计的真实效果只能通过实验来确认，因为有限元模型高度理想化，无法捕捉实验中的所有外部因素。
结论
本研究提出的cryo-FIB铣削方法能够生产适用于双轴cryo-ET的冷冻薄片。研究表明，多区域断层成像技术（PACE-tomo）可以应用于促进双轴断层成像的数据采集。细胞环境的双轴断层图性能优于应用于单轴断层图的现有缺失楔恢复方法。因此，双轴断层图增强了冷冻保存细胞结构的可解释性和分割准确性，并可作为基于深度学习的缺失楔恢复方法的真实数据基准。这项工作强调，进一步开发支持自由旋转的、机械稳定的Krios系统双轴样品台，不仅将实现双轴断层成像，还将有助于在样品台加载过程中旋转FIB-AutoGrids。样品台精度、能量过滤器、直接电子探测器和相位板的发展，有望进一步降低双轴cryo-ET所需的电子剂量。这些进步将使双轴断层成像成为结构细胞生物学中更加强大、准确和定量的分析工具。
此外，本文提出的计算模型为评估和优化新型铣削图案产生的薄片形状提供了一个有价值的工具。探索不同的连接处和应力释放切口几何形状的组合，代表了未来研究的一个有前景的方向。本文的探索基于现有实验设计，未来可以利用自动微分和形状优化方面的最新进展实现自动化。
