《Plant Biotechnology Journal》：LUCID: An Integrative Approach for Target Discovery and dsRNA Design in Plant Fungal Pathogens
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本综述系统介绍了一种名为LUCID的创新型计算流程，该流程通过整合转录组学与比较基因组学数据，实现了对植物病原真菌致病性靶点的快速鉴定及高效双链RNA（dsRNA）设计，为开发具有物种特异性、环境友好的RNA干扰（RNAi）生物杀菌剂提供了强有力的工具。研究发现，针对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的应用验证取得了高达67%的靶点成功沉默率和平均96%的沉默效率，并发现了一个新型致病性决定因子——推定的介体复合物蛋白，展现了其在可持续农业病害防控中的巨大潜力。
LUCID：整合靶点发现与dsRNA设计，开辟植物真菌病害防控新路径
植物病原真菌对全球粮食安全和生态系统稳定构成了日益严重的威胁。随着抗药性的产生和环境问题的凸显，传统化学杀菌剂的效力正在下降。基于双链RNA（dsRNA）的杀菌剂提供了一种物种特异性、环境友好的替代方案。本研究引入了一种名为LUCID（Locating Uncovered, conserved, and Indispensable for pathogenicity Determinants）的计算流程，旨在通过整合靶点鉴定、dsRNA设计和脱靶效应预测，加速基于RNA干扰（RNAi）的生物杀菌剂的开发。
1 引言
植物病原真菌造成的作物损失和经济破坏日益严重，且其多样性和入侵潜力预计将持续增长。传统广谱化学杀菌剂的使用已导致耐药菌株的出现，许多曾经有效的产品因生态和健康风险正被逐步淘汰。在此背景下，dsRNA作为一种靶向性强、可生物降解的替代品受到关注。它通过RNA干扰机制，特异性地沉默真菌生长和致病所需的关键基因，对非靶标生物和环境影响小，且不易引发抗性。然而，要充分发挥dsRNA杀菌剂的潜力，需要高效的计算工具来进行靶点筛选，而现有方法通常依赖于物种特异性的流程和劳动密集型的筛选，缺乏标准化解决方案。为此，我们开发了LUCID，一个三阶段的计算框架，旨在解决这一瓶颈。
2 结果
2.1 LUCID流程实现自动化靶点选择与dsRNA设计
LUCID是一个全自动生物信息学流程，分三个阶段运行：第一阶段（靶点选择）结合RNA测序数据、比较基因组学和精选的真菌数据库，识别植物病原真菌中的候选靶点。第二阶段（dsRNA设计）处理选定的转录本，以识别最佳沉默区域、生成dsRNA分子并设计扩增引物。第三阶段（脱靶预测）评估设计的dsRNA对用户提供的非靶标转录组的潜在交叉反应性，并可将已验证的靶点组合成多靶点嵌合dsRNA。
2.2 差异表达与保守性分析揭示真菌致病核心“武器库”
将LUCID应用于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）后，详细分析了感染期间的基因表达和保守性。主成分分析（PCA）揭示了体外对照与体内番茄感染样本间的清晰分离，火山图识别出1151个显著上调基因和1470个下调基因，热图显示了按条件聚类的不同表达谱。同时，对六种植物病原真菌的比较蛋白质组分析确定了3223个保守的orthogroups。功能富集分析显示，上调基因显著富集于植物细胞壁降解、碳水化合物代谢与转运、脂肪酸β-氧化、蛋白质水解和跨膜营养转运等过程。这些保守的orthogroups则富集于细胞内运输、蛋白质折叠与降解、RNA和DNA加工、繁殖和能量代谢等核心生物学过程。通过整合表达和保守性数据集，我们确定了225个在感染期间持续上调且在六种物种中保守的候选蛋白。2FC >?1; adjusted p-value
2.3 LUCID流程在灰葡萄孢菌中鉴定出13个CEP
LUCID流程通过对已知致病相关蛋白进行同源性搜索，在灰葡萄孢菌中鉴定出13个保守必需蛋白（CEP）。这些CEP根据其亚细胞定位和生物学功能被分为四大类：（a）内质网（ER）蛋白质质量控制与折叠机器；（b）过氧化物酶体蛋白；（c）调控信号蛋白；（d）代谢酶。这揭示了成功的植物感染需要跨多个必需细胞途径的协调调控。
2.4 LUCID流程在灰葡萄孢菌中鉴定出17个CNAP
LUCID流程还鉴定出17个高表达的保守非注释蛋白（CNAP）。通过整合序列同源性搜索和结构分析（使用ProteinCartography）的两步注释策略，推断出其潜在的致病作用。这些CNAP被组织成四个主要功能类别：（a）次级代谢与解毒蛋白；（b）过氧化物酶体功能与β-氧化蛋白；（c）膜动力学与转运蛋白；（d）转录控制蛋白。这种功能多样性凸显了成功感染需要跨多个细胞途径的协调调控。
2.5 LUCID流程能够产生用于基因沉默的高效dsRNA
为验证LUCID工作流程在识别RNAi杀菌剂靶点方面的效用，我们选择了部分候选基因进行dsRNA介导的沉默实验。定量RT-PCR分析显示，与GFP dsRNA阴性对照相比，所有靶点的基因均被显著沉默。对于CEP，表达水平被强烈抑制；在CNAP中，BcUNC1、BcUNC2和BcUNC3等也表现出显著抑制。植株内试验显示，dsRNA处理后，病害发展受到不同程度的抑制。BcHHK2（CEP）和BcUNC2（CNAP）效果最强。体外实验表明，dsRNA处理并未影响真菌的一般生长，这表明观察到的病害发展减少是特异性干扰致病相关基因的结果，而非一般生长抑制。
2.6 推定的介体复合物亚基作为致病性靶点的结构表征与功能分析
尽管BcUNC2在减少灰葡萄孢菌致病性方面效果最显著，但由于其卓越的沉默效率和一致的实验结果，我们选择BcUNC1进行详细的结构和功能分析。使用ProteinCartography和AlphaFold预测进行的结构分析显示，该蛋白结构具有介体复合物亚基特征的有序α-螺旋区域，以及广泛的固有无序区域（IDR）。这些无序区域可能参与蛋白质-蛋白质相互作用。共表达网络分析揭示了BcUNC1与一组共同表达的基因相连，这些基因有助于协调的毒力程序，包括次级代谢酶、氧化还原稳态组件和代谢酶。qPCR验证表明，BcUNC1的沉默导致大多数共表达靶点基因显著上调，这提示BcUNC1可能作为一个微调转录调节因子，协调感染期间毒力相关基因的受控表达，而非简单的直接激活剂。0.1, with node colours corresponding to module membership. (b) Subnetwork centred on mediator complex subunit (BcUNC1) within the brown module, illustrating its closest co-expressed neighbours. Node colours reflect log2 fold-change during infection: Red for upregulated genes, blue for downregulated. (c) RT-qPCR analysis of genes co-expressed with BcUNC1 in infected tomato plants treated with BcUNC1 dsRNA versus control dsRNA. Expression changes are shown as log2 fold-change.">
3 讨论
开发针对植物病原真菌的dsRNA控制策略在靶点识别和验证方面面临重大挑战。传统方法通常需要多年的经验测试。LUCID通过整合转录组和比较基因组数据，提供了一种新颖的计算管道来识别最佳靶点。在灰葡萄孢菌中的应用表明，LUCID识别出的靶点（包括CEP和CNAP）在沉默实验中取得了高成功率，显著降低了病害发展。其中，过氧化物酶体相关蛋白的突出地位以及通过CNAP分支识别出的新型毒力因子（如BcUNC1）尤为引人注目。BcUNC1的结构和共表达网络分析支持其作为转录调节因子，在协调毒力程序中的关键作用。LUCID的双分支策略通过系统整合多种数据，证明在识别沉默靶点方面高度有效。此外，该流程集成了脱靶预测和嵌合dsRNA设计功能，有助于降低非靶标生物风险并设计广谱制剂。虽然研究中使用的dsRNA浓度（50 ng/μL）在近期验证中有效，但田间应用仍需进行浓度优化以平衡功效和成本效益。在生物技术领域，LUCID这样的强大计算工具对于降低研发风险、聚焦于最有潜力的计算识别靶点至关重要。
4 实验流程
4.1 LUCID工作流程
LUCID是一个旨在识别植物病原真菌中RNA干扰控制策略最佳靶点的新型计算流程。它分两个阶段运行：第一阶段（靶点选择）利用转录组和基因组数据来发现候选沉默基因；第二阶段（dsRNA设计）专注于设计有效的双链RNA分子。源代码和指南可公开获取。
4.2 数据来源与准备
为识别灰葡萄孢菌中的RNAi靶点，从NCBI检索了B05.10菌株在番茄感染和体外生长条件下的转录组数据。用于比对和注释的参考基因组来自Ensembl Fungi。为进行保守性分析，从Ensembl Fungi获取了六种植物病原真菌的蛋白质组。为促进CEP的同源性识别，整合了PHI-base、DEG、VEuPathDB和DFVF等多个资源，构建了一个精选的致病性数据库。
4.3 用于同源性、转录组学和同源性分析的计算方法
使用OrthoFinder进行同源性分析。使用Rsubread包进行读段比对和定量，随后使用DESeq2进行差异表达分析。使用DIAMOND对我们精选的必需和毒力相关基因数据库进行同源性搜索。
4.4 注释工具
为识别CNAP，我们专注于那些保守、上调但在UniProt条目中缺乏功能注释或表征的蛋白质。初步功能预测使用大规模BLAST搜索。经过这些分析后仍未被表征的蛋白质则使用ProteinCartography进行进一步检查。使用DeepLoc 2.0获取所有蛋白质的预测亚细胞定位，使用AlphaFold2预测3D结构。使用DAVID进行功能富集分析。对于涉及固有无序区域的蛋白质-蛋白质相互作用，使用DisoRDPbind。
4.5 植物、微生物、核酸提取与cDNA合成
番茄‘Moneymaker’植株在24°C、16小时光照/8小时黑暗条件下培养，用于dsRNA测定。灰葡萄孢菌B05.10在PDA上保存。使用TRI Reagent提取总RNA，使用NanoDrop 2000测定浓度，使用Superscript III逆转录酶和随机引物进行cDNA合成。
4.6 体外dsRNA生产
将靶序列克隆到带有相反T7 RNA聚合酶启动子的质粒中，随后用侧翼T7序列进行一步PCR扩增，并进行体外转录。
4.7 dsRNA介导的基因沉默测定
植株内dsRNA介导的基因沉默测定采用改进的离体叶片测定法进行。将含有dsRNA的溶液与灰葡萄孢菌孢子混合，施加于叶面。使用ImageJ软件在接种后72小时测量病斑直径以评估病害症状。体外测定则在固体和液体培养基中进行，评估生长抑制情况。使用Python进行统计学分析。
4.8 定量逆转录RT-qPCR
使用Primer3软件设计引物，排除dsRNA靶向区域以防止扩增偏倚。使用Superscript III合成cDNA。在Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统上使用KAPA SYBR FAST试剂进行RT-qPCR。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达量。
4.9 共表达网络构建
为探索灰葡萄孢菌中的基因共表达模式，使用来自NCBI BioProject PRJNA439019的RNA-seq数据进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。使用WGCNA R包构建共表达网络，应用无符号网络类型、软阈值功率为10等参数。为量化和可视化共表达关系，计算了邻接矩阵，并通过TOMsimilarity函数生成了拓扑重叠矩阵（TOM）。
5 作者贡献、资助与利益冲突
á.P., A.P.-G. 和 L.J.-C. 设计并规划了实验。A.L.-L. 和 L.J.-C. 进行了实验和数据分析。L.J.-C. 和 á.P. 撰写了手稿。A.P.-G. 和 D.F.-O. 修订了手稿。á.P. 和 A.P.-G. 监督了研究。所有作者阅读并批准了其内容。本研究得到了AYUDAS A LA I+D+i EN EL áMBITO DEL PLAN ANDALUZ DE INVESTIGACIóN, DESARROLLO E INNOVACIóN (PAIDI 2020) (PY20_00048) 和 MICIU/AEI/10.13039/501100011033 以及 ERDF/EU (PID2022-136240OB-C21) 的支持。开放获取费用由 Universidad de Málaga / CBUA 资助。作者声明无利益冲突。
6 数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在LUCID的GitHub仓库公开获取。
